發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 07:58

  本文關(guān)鍵詞： 三味干姜散 酒精性肝損傷 免疫性肝損傷 肝臟線(xiàn)粒體 血清藥物化學(xué)　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:本課題從保護(hù)肝臟線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的角度出發(fā),復(fù)制酒精性肝損傷模型和ConA免疫性肝損傷模型,探討三味干姜散的保肝機(jī)制,并研究其入血成分,為三味干姜散的臨床應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。方法:1.將72只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、酒精模型組、水飛薊素陽(yáng)性組、三味干姜散高、中、低劑量干預(yù)組。除正常組以外,各組上午灌胃55%酒精,下午灌胃相應(yīng)藥物,連續(xù)10d,正常組灌胃相應(yīng)劑量的蒸餾水,制備酒精性肝損傷大鼠模型,在末次給藥12h以后,2%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動(dòng)脈取血,分離的血清用于檢測(cè)肝功指標(biāo)ALT、AST,肝臟用于HE切片染色進(jìn)行病理觀(guān)察,提取的肝臟線(xiàn)粒體用于檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位、膜通透性、SOD、8-OHdG、呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ;制備肝勻漿檢測(cè)MDA、GSH、GSH-Px,RT-PCR 檢測(cè)肝細(xì)胞中 Nrf2、Bach1 和 HO-1 mRNA 的表達(dá);Western Blot檢測(cè)肝組織中Nrf2、Bach1以及HO-1蛋白的表達(dá)水平。2.將72只KM小鼠隨機(jī)分為正常組、ConA模型組、水飛薊素陽(yáng)性組、三味干姜散高、中、低劑量干預(yù)組。除正常組以外,各組每天灌胃相應(yīng)體積藥物1次,連續(xù)7d,正常組灌胃等體積的蒸餾水,在末次給藥以后12h,除正常組外,其余各組尾靜脈注射ConA 25mg/kg,制備ConA免疫性肝損傷模型。造模4h后眼球取血,分離出的血清用于檢測(cè)肝功指標(biāo)ALT、AST,分離的肝臟用于HE切片染色進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察,提取的肝臟線(xiàn)粒體檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位、SOD、8-OHdG,制備肝勻漿測(cè)定MDA、GSH、GSH-Px。3.通過(guò)超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定,并建立三味干姜散化學(xué)成分信息庫(kù),利用Peakview軟件對(duì)三味干姜散含藥血清、空白血清、單復(fù)方化合物成分進(jìn)行篩查,以6-姜酚對(duì)照品,以期尋找三味干姜散入血成分。結(jié)果:1.用55%酒精給SD大鼠灌胃造模10天后,發(fā)現(xiàn)酒精模型組血清中的ALT、AST水平升高(P0.01);HE切片染色病理觀(guān)察結(jié)果表明,酒精模型組肝小葉之間的界限不是很清晰,肝細(xì)胞索發(fā)生紊亂,肝竇范圍變窄,肝細(xì)胞也濁腫,而胞質(zhì)出現(xiàn)疏松,淡染,更有大部分的肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹,呈現(xiàn)出氣球樣的病變。酒精模型組的熒光強(qiáng)度比值下降,表明JC-1單體增多,膜電位△Ψm下降(P0.05),在1Omin以?xún)?nèi)A540值迅速下降,△A540值上升明顯(P0.05),表明線(xiàn)粒體容積增大,光散射性下降。SOD酶活性顯著下降(P0.01),GSH-Px酶活性顯著下降(P0.01),GSH活性下降(P0.05);MDA活性顯著增加(P0.01),8-OHdG含量顯著增加(P0.01);2.呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ酶活性顯著性降低(P0.01);肝組織中的Nrf2、Bach1、HO-1mRNA的表達(dá)水平提高,其中Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)水平(P0.05),Bach1 mRNA表達(dá)水平(P0.01)。三味干姜散干預(yù)組肝細(xì)胞水腫癥狀均有不同程度緩解,三味干姜散高劑量能降低血清中ALT水平(P0.05),能升高SOD酶活性(P0.05),升高GSH-Px酶活性(P0.05),能增加GSH酶活性(P0.01),10min內(nèi)△A540下降(P0.05),能降低8-OHdG含量(P0.01),降低MDA活性(P0.01),能顯著增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ酶活性(P0.01),增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ(P0.05),能上調(diào)Nrf2和HO-1mRNA的表達(dá)(P0.05);中劑量能降低血清中ALT、AST水平(P0.05);能增加GSH酶活性(P0.01),能顯著降低8-OHdG含量(P0.01)、降低MDA活性(P0.05),能顯著增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ酶活性(P0.01);低劑量組能降低MDA活性和8-OHdG含量(P0.05),增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ酶活性(P0.05)。2.尾靜脈注射ConA造模后,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中ALT、AST水平顯著上升(P0.01);HE切片染色病理學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),模型組的肝細(xì)胞發(fā)生水腫,有的充血壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)也受到破壞,嚴(yán)重的還出現(xiàn)小灶樣壞死以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)被大量炎性細(xì)胞所浸潤(rùn)。模型組的熒光強(qiáng)度比值下降,表明JC-1單體可能增多,膜電位△Ψm明顯下降(P0.05),并且在10min以?xún)?nèi)A540值迅速下降,△A540值明顯上升(P0.05),表明線(xiàn)粒體容積可能增大,光散射性下降;SOD酶、GSH-Px酶活性顯著下降(P0.01),GSH活性下降(P0.01);MDA活性顯著增加(P0.05),而8-OHdG含量卻顯著增加(P0.01);在病理觀(guān)察中,三味干姜散干預(yù)組對(duì)于模型組出現(xiàn)的肝細(xì)胞狀況都有著不同程度緩解,其中高劑量組能顯著降低血清中的ALT、AST的含量水平(P0.01),能升高SOD酶活性(P0.05),升高GSH-Px、GSH酶活性(P0.01),能降低8-OHdG含量(P0.01),降低MDA活性(P0.01);中劑量組的熒光強(qiáng)度比值增加,表明JC-1聚合物可能增多,膜電位△Ψm明顯上升(P0.01),還能增加GSH-Px酶活性(P0.05),能降低8-OHdG含量(P0.01);低劑量能升高GSH酶活性(P0.05)。3.以6-姜酚作為對(duì)照品,對(duì)空白血清、三味干姜散含藥血清、復(fù)方以及單方進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)6-姜酚在含藥血清、三味干姜散復(fù)方以及干姜單方中的保留時(shí)間基本一致,其在二級(jí)質(zhì)譜圖中的特征碎片峰基本一致,提示6-姜酚可能是以原型入血。結(jié)論:1.三味干姜散的保肝作用與其對(duì)肝臟線(xiàn)粒體的保護(hù)有關(guān),具體表現(xiàn)為保護(hù)線(xiàn)粒體的膜結(jié)構(gòu)、提高抗氧化酶的數(shù)量,減輕DNA的氧化損傷以及恢復(fù)線(xiàn)粒體的氧化還原系統(tǒng),調(diào)控內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),減輕機(jī)體脂質(zhì)抗氧化反應(yīng),上調(diào)Nrf2、Bach1以及HO-1基因和蛋白的表達(dá)。2.經(jīng)過(guò)UPLC-MS法檢測(cè)得出6-姜酚可能是三味干姜散的入血成分,并以原型入血。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
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本文編號(hào)：1481370