本文關(guān)鍵詞： 盤狀結(jié)構(gòu)域受體1 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 腦缺血再灌注損傷 血腦屏障 大鼠　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 卒中（尤其是缺血性腦卒中）仍然是威脅我國(guó)國(guó)民健康的主要?dú)⑹种�，在我�?guó)，腦卒中具有高發(fā)病率、高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)；同時(shí)，腦卒中給社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和巨額的財(cái)政支出[2]。目前，臨床中最主要治療卒中的方式是組織型纖溶酶原激活物（tPA）；然而，由于治療時(shí)間窗窄[1]，使得這唯一有效的治療干預(yù)方式的使用受到了極大的限制。因此，認(rèn)識(shí)卒中發(fā)生的機(jī)制并針對(duì)性地研究新而有效的干預(yù)措施已是迫在眉睫。 血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是存在于血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的一道物理屏障，其主要功能是監(jiān)管出入物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受各種內(nèi)外因素的傷害；因此，BBB在維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[3]。然而，血腦屏障的損傷將會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)退行性變以及中樞神經(jīng)功能的障礙。引起血腦屏障破壞的因素很多，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallop roteinases, MMPs）、氧化應(yīng)激、血管生成因子、炎性細(xì)胞因子、自身抗體、白細(xì)胞粘附因子、免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和各種病原體，它們的共同特點(diǎn)是均會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)的減少、基底膜的降解和血腦屏障通透性的增加，進(jìn)而加重腦損傷的程度[4]。 MMPs是一組Zn2依賴性內(nèi)肽酶，能夠降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)。各種外源性損傷因子或大腦的缺血再灌注損傷均會(huì)引起炎性反應(yīng)和氧自由基的增加，這些損傷因子激活MMP9、MMP3等基質(zhì)金屬蛋白酶類后降解BBB的基底膜成分和細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而引起血腦屏障的破壞；而血腦屏障的破壞又可反過來加重腦損傷程度，導(dǎo)致血管源性腦水腫以及一系列的腦損傷[5]。在MMPs中，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）與腦梗死程度關(guān)系密切[6]。腦缺血/再灌注損傷后表達(dá)上調(diào)的MMP9通過降解基底膜，破壞血腦屏障，加重腦損傷；因此，抑制腦缺血損傷后MMP-9的表達(dá)、保護(hù)血腦屏障的完整性可能是減輕腦損傷的重要措施。 盤狀結(jié)構(gòu)域受體1（discoidin domain receptor l，DDR1），屬于圓盤狀的結(jié)構(gòu)域受體酪氨酸激酶類（DDRs），它的主要功能是調(diào)控膠原的合成及降解、酶活性并監(jiān)控細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)成分的形成；有研究表明，ECM的破壞在腫瘤組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中同樣也起著非常關(guān)鍵的作用[7]。以往許多腫瘤研究已證實(shí)DDR1可通過與各型膠原（I-V型）的結(jié)合介導(dǎo)MMP9的表達(dá)和活性，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散中起到了非常關(guān)鍵的作用[8,9]；但是DDR1和MMP9的關(guān)系在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究較少，而在腦缺血損傷后并未見報(bào)道；所以我們通過建立大鼠的MCAO模型來觀察腦缺血再灌注損傷后DDR1的表達(dá)改變及其對(duì)MMP9的影響和機(jī)制，并觀察下調(diào)DDR1的表達(dá)水平對(duì)血腦屏障通透性的作用，為缺血性腦損傷后血腦屏障的破壞提供一個(gè)新的有效的治療手段。 實(shí)驗(yàn)一、腦缺血再灌注損傷后DDR1蛋白及其磷酸化水平的表達(dá)改變 目的：采用大鼠的在體MCAO模型觀察腦缺血及再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平的表達(dá)改變情況。 方法：健康成年雄性SD大鼠55只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham）、缺血再灌注組（MCAO）、siRNA處理組(siRNA)和siRNA錯(cuò)配組(siRNA-c)。sham組僅分離血管，不進(jìn)行線栓阻塞；MCAO組在大腦中動(dòng)脈阻塞2小時(shí),分別于再灌注3h，6h,12h,24h后1.5倍的正常麻醉劑量下處死大鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5)；siRNA組在MCAO前3天側(cè)腦室轉(zhuǎn)染DDR1-siRNA，于缺血2h再灌注24h后處死大鼠；siRNA-c組在MCAO前3天側(cè)腦室轉(zhuǎn)染DDR1-siRNA-c，于缺血2h再灌注24h后處死大鼠。各組均取同側(cè)缺血半暗帶組織進(jìn)行Western blotting檢測(cè)DDR1及其磷酸化水平的表達(dá)改變(n=5)；另外,各組于腹腔灌注并固定后連續(xù)冰凍切片，使用DDR1和NeuN的免疫熒光雙標(biāo)來觀察DDR1在神經(jīng)元上的表達(dá)改變(n=5)。 結(jié)果：與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注損傷后DDR1蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平伴隨再灌注時(shí)間的持續(xù)明顯上調(diào)，并于再灌注24h達(dá)到高峰；而通過側(cè)腦室注射DDR1的siRNA后，DDR1蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平相比MCAO組明顯下調(diào),（P0.01MCAO vs.sham； P0.01siRNA vs.MCAO）；另外，注射siRNA-c組DDR1的表達(dá)同MCAO組相比無明顯改變（P＞0.05）。 結(jié)論：腦缺血再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平隨著再灌注損傷時(shí)間的持續(xù)均有不同程度的升高。 實(shí)驗(yàn)二、抑制DDR1的過表達(dá)對(duì)MMP9表達(dá)和活性的影響 目的：采用大鼠在體MCAO模型來觀察抑制DDR1的過表達(dá)后MMP9的表達(dá)水平和酶蛋白活性的改變情況。 方法：健康成年雄性SD大鼠35只，體重280～320g，分組和處理方法同實(shí)驗(yàn)一，各組取同側(cè)缺血半暗帶組織進(jìn)行Western blotting和明膠酶譜分析法檢測(cè)MMP9的酶蛋白表達(dá)及其酶活性改變。 結(jié)果：正常情況下，，MMP9的表達(dá)和活性極低，腦缺再灌注損傷后MMP9的表達(dá)和活性伴隨再灌注時(shí)間的持續(xù)明顯上調(diào)，并于再灌注24h達(dá)到高峰。側(cè)腦室注射siRNA抑制DDR1的表達(dá)后，MMP9的表達(dá)和活性明顯下調(diào)（P0.01MCAO vs.sham；P0.01siRNA vs.MCAO）；注射siRNA-c組MMP9的表達(dá)同MCAO組相比無明顯改變（P＞0.05）。 結(jié)論：DDR1siRNA可降低腦缺血損傷后缺血半暗帶區(qū)MMP9的表達(dá)和酶活性。 實(shí)驗(yàn)三、下調(diào)DDR1蛋白表達(dá)及其磷酸化水平對(duì)血腦屏障通透性的影響 目的：采用大鼠在體MCAO模型觀察下調(diào)DDR1及其磷酸化的表達(dá)對(duì)血腦屏障通透性、腦梗死容積和神經(jīng)行為學(xué)的影響。 方法：健康成年雄性SD大鼠112只，體重280～320g，分組方法同實(shí)驗(yàn)一。MCAO后，大腦中動(dòng)脈阻塞2小時(shí),分別于再灌注24h后處死大鼠。采用伊文思藍(lán)染色評(píng)估血腦屏障的通透性(n=12)、干濕比重法測(cè)定腦水含量(n=8)、TTC染色法來評(píng)估梗死后的容積百分比(n=8)。 結(jié)果：和假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注損傷后，大鼠的血腦屏障通透性（伊文思藍(lán)含量：9.464±0.5342μg/g；腦水含量：83.73±0.44%）升高，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（6.250±0.8864）降低，腦梗死容積(44.75±3.778%)增加；與MCAO組相比，siRNA組大鼠的血腦屏障通透性（伊文思藍(lán)含量：4.614±1.142μg/g；腦水含量：79.76±1.05%）降低，神經(jīng)行為學(xué)（12.63±1.408）明顯改善，腦梗死容積（22.45±3.018%）明顯減少（P 0.05），（P0.01MCAO vs.sham； P0.01siRNA vs.MCAO）。 結(jié)論：抑制DDR1及其磷酸化的過表達(dá)可有效減輕血腦屏障通透性增加，減少腦梗死容積，改善神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。 小結(jié) 我們的研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平明顯上調(diào)、BBB通透性增高、腦梗死容積增大、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低。抑制DDR1的過表達(dá)可減輕MCAO后BBB的通透性，并可減輕缺血再灌注后的腦損傷。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，DDR1蛋白可能是通過上調(diào)其下游分子MMP9的表達(dá)量及酶活性造成缺血后BBB通透性增高和腦損傷的。本研究為我們提供了一個(gè)新的思路即：特異性地抑制DDR1的過表達(dá)或許就有可能起到保護(hù)血腦屏障、降低缺血性卒中的發(fā)生率的作用。本課題為腦缺血后BBB損傷的研究拓寬了思路，下一步我們將從DDR1調(diào)控MMP9的中間分子機(jī)制入手，進(jìn)一步揭示DDR1-MMP9通路在腦缺血后BBB損傷中發(fā)揮的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 何苗;傅仲學(xué);;DDR1a在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及與基質(zhì)金屬蛋白酶2,9的關(guān)系[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

2 ;Relationship between preoperative staging by endoscopic ultrasonography and MMP-9 expression in gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2007年14期

本文編號(hào)：1474159