發(fā)布時間：2018-01-26 02:25

  本文關鍵詞： 腳橋被蓋核 低頻電刺激 帕金森病 Catwalk步態(tài)系統 曠場實驗　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景： 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種以黑質致密部多巴胺能神經元變性、壞死為主要病變的神經系統疾病,典型臨床癥狀為靜止性震顫(resting tremor)、肌肉僵直(muscular rigidity)、運動遲緩(bradykinesia),同時約半數以上的PD患者,在晚期會出現起步困難、姿勢不穩(wěn)、步態(tài)紊亂等軸性癥狀(Postural instability/gait disorder, PIGD),而這種軸性癥狀嚴重的影響了患者的生活質量,雖然傳統的核團毀損術、多巴胺藥物替代治療及高頻電刺激蒼白球內側部、丘腦底核或丘腦腹側核均可改善病人典型癥狀,但是對病人出現的軸性癥狀療效甚微。 Plaha P及其同事在2005年首次報道了低頻電刺激(low frequency stimulation,LFS)腳橋核(pedunculopontine nucleus,PPN,在鼠類相當于腳橋被蓋網狀核,pedunculopontine tegmental nucleus,PPTg,)可明顯改善PD病人的步態(tài)紊亂、姿態(tài)不穩(wěn)等PIGD癥狀,同時有研究表明,PD狀態(tài)下,PPN的神經元會發(fā)生不同程度變性、凋亡以及殘余神經元出現不規(guī)則放電、代償性地異常過度放電；這些都提示PPN不僅在PD發(fā)病過程中起著重要作用,而且PPN可能參與運動功能的調節(jié),并且這種運動功能的調節(jié)可能同PIGD癥狀相關。隨后PPN作為一種新的靶核團受到人們越來越多的關注。大量臨床研究已證實低頻電刺激PPN可改善PD病人姿勢不穩(wěn)、步態(tài)紊亂等PIGD癥狀,但是對于其作用的機理尚不明確,而低頻電刺激PPN對動物行為學影響的研究較臨床研究的滯后性,使得闡明這種作用機理愈發(fā)困難,因此通過動物實驗探討低頻電刺激PPN對行為學的影響是極為重要的。 單側注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)同時在特定的神經核團植入電極的偏側PD大鼠模型具有可重復性,穩(wěn)定性特點,這種模型已被證實可作為研究深部電刺激丘腦底核對PD大鼠行為學影響的一種理想的動物模型。雖然有大量的行為學方法用于檢測偏側PD大鼠行為學的改變(如BBB評分、足跡實驗,爬梯實驗及平衡木實驗)但這些實驗所得數據存在較大的人為主觀性,所得結論有待進一步商榷,因此在行為學檢測中盡量客觀的行為學檢測方法及指標是極為重要的,本實驗擬采用的Catwalk步態(tài)檢測系統及曠場實驗(open field test),是相對理想的兩種行為學檢測方法,它們極大避免了人為因素對動物行為學的影響,并且這兩種檢測方法已被廣泛的用于脊髓損傷、腦缺血、PD等動物模型行為學得檢測,已經得到了越來越多的學者的認可。 目的： 本研究擬采用Catwalk步態(tài)檢測系統和曠場實驗評估低頻電刺激腳橋被蓋網狀核對6-OHDA所致偏側PD大鼠行為學的影響,為深入研究低頻電刺激腳橋核治療晚期PD提供理論基礎。方法： 1.動物分組：32只SD大鼠按完全隨機數字表法將其分為對照組(6-OHDA 組,n=8)、實驗組(6-OHDA電極植入組,n=24)。 2.立體定向手術及電極植入 大鼠腹腔注射3.6%水合氯醛(100g/ml)麻醉后,固定于立體定向儀上,常規(guī)消毒,剪開頭皮,剝離骨膜,暴露顱骨,將顱骨前后囟調平。根據Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定右側前腦內側束(medial forebrain bundle,MFB)和PPTg坐標(MFB:AP:-1.8mm, ML:-2.1mm, DV:-8.3mm。PPTg: AP:-7.9mm, ML:-2.1mm, DV:-7.0mm),用10μL微量進樣器在MFB處注射新鮮配置的含0.02%抗壞血酸鹽的6-OHDA溶液(4μL/10μg),隨后在顯微鏡下將8導鎢絲刺激電極(每根電極尖端直徑為50μm)植入PPTg,用60°左右生理鹽水洗脫電極,牙科水泥固定并堆積成電極連接的平臺(headstage)。對照組僅在MFB處注射6-OHDA,骨蠟覆蓋鉆孔,縫合皮膚。各組大鼠在術后一周恢復期內自由飲食飲水；兩周后自由飲水,每日進食量限制在10g左右,以控制體重。 3.PPTg-LFS 大鼠頭部刺激電極通過導電滑環(huán)與刺激隔離器輸出端連接,刺激器輸出端的電纜套上金屬螺旋管,以防刺激過程中大鼠對電纜造成損壞。從8導刺激電極中篩選出兩根最有效的電極作為刺激的正負極。刺激參數：單脈沖,方波,頻率25Hz,波寬80μs,幅值2-8V。每只大鼠的刺激幅值為個體刺激閾值的80%。每只大鼠從2V開始給予刺激,以0.1V為單位向上調,刺激時間少于10s,相鄰刺激間隔至少間隔1min,直到出現刺激副作用時(比如,大鼠胡須直立、頭部抖動等)的幅值為個體的刺激閾值。 4.行為學檢測 所有大鼠在立體定向手術前1周進行Catwalk及曠場實驗數據采集作為行為學基線值,術后21天后所有大鼠再行Catwalk及曠場實驗數據采集,術后四周后6-OHDA電極組行PPTg-LFS時,再次采集行為學數據。 (1)曠場實驗：所用裝置為：直徑80cm,高50cm,由工程塑料合金合成的圓柱形礦場反應箱(荷蘭Noldus公司)。將大鼠放在反應箱的中央部,保持周圍的環(huán)境安靜,光線適中,大鼠先適應環(huán)境10min后,記錄5min內大鼠移動的距離、運動軌跡及速度。 (2)Catwalk步態(tài)采集：Catwalk步態(tài)分析系統是一種自動化的計算機輔助的步態(tài)分析技術,它主要由內置熒光燈的玻璃板、高頻攝像頭組成。當大鼠通過玻璃板時,熒光會從底部反射出爪印的形狀,被下方的攝像頭捕捉到,傳送到計算機,進行離線分析。大鼠適應性訓練一周以后開始記錄數據,記錄標準為大鼠連續(xù)的、不間斷的通過通道,并且每次通過至少有10步,每只大鼠至少記錄三次。 5.免疫組化及尼氏染色(Nissle) 行為學檢測后,大鼠腹腔麻醉,將刺激電極通過牙科水泥固定形成的平臺與刺激器相連,給予高于個體閾值的電壓通電,使得電極尖端在腦組織上留下氧化后的痕跡,以確定刺激電極的尖端的位置。隨后對大鼠開胸,經左心室穿刺入主動脈進行灌注固定：先用0.9%的生理鹽水300ml預灌注,再用4%多聚甲醛溶液300m1固定,斷頭并完整取出腦組織,置于4%的多甲溶液中24小時后,再置于30%的蔗糖溶液中,直至腦組織完全下沉。將固定脫水后的腦組織行冰凍切片,片厚約25μm,取黑質致密部行絡氨酸羥化酶免疫組化染色,腳橋核行尼氏染色。 6.統計學分析 采用spssl7.0進行數據分析。計量資料用均數±標準差(x±S),所有大鼠術前同術后均數比較采用配對樣本t檢驗；6-OHDA電極植入組在PPTg刺激前、后的計量資料比較采用配對樣本t檢驗,實驗組和對照組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P0.05為差異有統計學意義。 結果： 1. Catwalk檢測結果：所有大鼠術后的速度變化百分比(run speed variation)、雙爪耦合(Couplings,右前→左前,右前→左后,右后→左前,右后→左后)較術前明顯增加,每秒步數(Cadence)明顯減少,6-OHDA電極組大鼠行LFS-PPTg時速度變化百分比及雙爪耦合(右前→左前,右前→左后,右后→左前,右后→左后)較術后顯著下降,每秒步數較術后增加,差異均有統計學意義(P0.05)。 2.曠場實驗檢測結果：所有大鼠術后運動距離較術前明顯下降,差異有統計學意義(P0.05),實驗組(6-OHDA電極組)行LFS-PPTg時,運動距離較術后有所增加,且差異顯著(P0.05)。 3.實驗組和對照組行為學比較：立體定向術前,實驗組同對照組所有大鼠在曠場實驗和Catwalk步態(tài)檢測所得的行為學數據無差異(P0.05)；術后未行電刺激前實驗組同對照組相比也無差異(P0.05)。 結論： 低頻電刺激腳橋被蓋網狀核后,PD大鼠的運動能力及一些反應臨床上PD軸性癥狀的步態(tài)的到改善,說明偏側PD大鼠PPN植入電極的模型同Catwalk及曠場實驗結合,能很好的反應PD軸性癥狀和運動能力的改變。這為進一步研究LFS-PPN作用機理提供了很好的行為學基礎,因此這種行為學同進一步的病理生理及同步記錄相關神經元的電生理活動相結合,可能會為LFS-PPN作用機理提供新的理論基礎,從而推動LFS-PPN在臨床的廣泛應用,使飽受軸性癥狀困擾的病人不再深受其害。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 孫兵,惠國楨,郭禮和,REISER Jakob;慢病毒介導GDNF對帕金森病的多巴胺能神經營養(yǎng)作用(英文)[J];生物化學與生物物理學報;2003年10期

2 王述菊;方劍喬;馬駿;王彥春;曾曉玲;周丹;孫國杰;;電針對帕金森病模型大鼠中腦黑質p38絲裂原活化蛋白激酶的影響[J];中國針灸;2013年04期

，

本文編號：1464391