本文關(guān)鍵詞： 骨性關(guān)節(jié)炎 軟骨下關(guān) 關(guān)節(jié)軟骨 血管形成 常山酮　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景骨性關(guān)節(jié)炎是最常見(jiàn)的多因素引起的關(guān)節(jié)退行性疾病,以進(jìn)行性的關(guān)節(jié)軟骨損傷、軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)周圍骨贅形成為特征。關(guān)節(jié)疼痛是患者主要的臨床表現(xiàn)。目前臨床上對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療沒(méi)有特別有效的方法,主要以緩解患者癥狀及關(guān)節(jié)功能從而有限的改善患者生活質(zhì)量為目標(biāo)。關(guān)節(jié)置換是骨性關(guān)節(jié)炎晚期患者必需面臨的選擇。但是關(guān)節(jié)置換手術(shù)創(chuàng)傷大,花費(fèi)高,同時(shí)也伴隨著手術(shù)失敗及后續(xù)翻修的風(fēng)險(xiǎn)。骨性關(guān)節(jié)炎已經(jīng)為社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),同時(shí)在中國(guó)正逐步步入老齡化的今天,這種經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)將會(huì)進(jìn)一步增加。目前找到一種有效的預(yù)防或治療骨性關(guān)節(jié)炎的方法是迫切需要的。近期國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制方面所取得的進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的視點(diǎn)。越來(lái)越多的基礎(chǔ)和臨床研究支持骨性關(guān)節(jié)炎不僅僅是軟骨病患,而是整個(gè)關(guān)節(jié)包括軟骨和軟骨下骨整體的疾病。軟骨下骨為軟骨提供力學(xué)支持,同時(shí)軟骨下骨自身不斷進(jìn)行著動(dòng)態(tài)的適度的重塑去適應(yīng)周圍微環(huán)境的變化。近期研究表明,在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病進(jìn)程中,軟骨下骨在異常的力學(xué)刺激下骨吸收異常增加,在軟骨下骨可見(jiàn)異常增多的TRAP細(xì)胞。增強(qiáng)的骨吸收激活釋放過(guò)量的埋藏在骨基質(zhì)中的陰性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β,進(jìn)而誘導(dǎo)異常的、骨吸收和骨形成未偶聯(lián)的重塑：過(guò)量激活的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)動(dòng)員誘導(dǎo)至骨髓腔形成異位“骨島”,而不能到達(dá)骨吸收部位去形成新骨以偶聯(lián)骨吸收,從而改變了軟骨下骨對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)力刺激,最終引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞而誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制的有幾點(diǎn)共識(shí)：異常的力學(xué)刺激在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用,這種異常的力學(xué)刺激將誘導(dǎo)軟骨下骨進(jìn)行異常的未偶聯(lián)的骨重塑；骨性關(guān)節(jié)炎不僅僅是關(guān)節(jié)軟骨疾病,軟骨下骨與關(guān)節(jié)軟骨是一對(duì)功能共同體,在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中相互協(xié)調(diào)、相互影響；骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨相互影響的以及是不斷累積的過(guò)程。常山酮是從一種植物常山里所提取出來(lái)的物質(zhì)。常山酮作為中藥的成分被用來(lái)治療瘧疾在中國(guó)已有兩千多年的歷史。近期研究表明,常山酮可以被用來(lái)治療纖維化的疾病,通知抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β通路的smad2/3磷酸化；同時(shí)常山酮可以用來(lái)抑制Th17細(xì)胞的分化,而近年來(lái)研究表明Th17細(xì)胞可以分泌IL1 7誘導(dǎo)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化從而增強(qiáng)骨吸收；血管形成也被認(rèn)為是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的一個(gè)重要原因,亦有報(bào)道表明常山酮可以從多個(gè)階段來(lái)抑制血管的形成。本研究旨在通過(guò)研究常山酮對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β通路、Th17細(xì)胞分化以及血管形成方面的作用來(lái)探討闡述骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制,為骨性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和臨床治療提供一個(gè)新的視點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。二、研究方法(一)常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨及關(guān)節(jié)軟骨的影響1,動(dòng)物模型的建立我們從Charles River購(gòu)買了3個(gè)月大小的雄性的C57BL/6J (WT)小鼠和Lewis大鼠。鼠被分為三組：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組給予常山酮及實(shí)驗(yàn)組給予安慰劑PBS。小鼠藥物注射為腹腔內(nèi)注射,劑量為1mg/kg,隔天一次,注射一個(gè)月。大鼠予以局部包埋藥物。鼠在麻醉的狀態(tài)下予以做前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)以建立骨性關(guān)節(jié)炎模型。麻醉方法：購(gòu)買的麻醉藥有20mg/ml的Xylazine(甲苯噻嗪)及100mg/ml的Ketamine(克他命)。將20mg/ml的Xylazine(甲苯噻嗪)稀釋至2mg/ml。我們用需要配制麻藥的總體積數(shù)除以8.3以獲得2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的體積數(shù),再用總體積減去2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的體積數(shù)即為100mg/ml的Ketamine(克他命)的量。比如我們配制總體積數(shù)5m1的量,2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的體積為5/8.3=0.6m1,則100mg/ml的Ketamine(克他命)的量為5-0.6=4.4m1。將0.6m1的2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)與4.4 ml的100mg/ml的Ketamine(克他命)混合即為我們需要的麻醉劑。每只老鼠的用量(20-26克)約為100-120微升。老鼠麻醉后,將老鼠固定在顯微鏡的平臺(tái)上,將老鼠將要做手術(shù)的腿固定屈曲90度以便于切斷前交叉韌帶。實(shí)驗(yàn)技巧：剪毛,只用酒精浸濕的紗布擦濕毛發(fā)即可,不要用噴霧器去噴,黏貼膠布打濕后很難再次黏住,給手術(shù)帶來(lái)很多不必要的困惑；打開(kāi)膝上皮膚,用鑷子鈍性分離皮下筋膜,避開(kāi)皮下血管。從股內(nèi)側(cè)肌形成髕韌帶的連接處剪開(kāi)股內(nèi)側(cè)肌,注意避開(kāi)股內(nèi)側(cè)肌肌肉內(nèi)的血管,避免出血。此時(shí)的難點(diǎn)在于將髕骨推至外側(cè)以暴露膝關(guān)節(jié)間隙。手術(shù)技巧在于用剪刀進(jìn)一步剪開(kāi)骨外膜,將骨外膜剪開(kāi)后,即可輕易將髕骨推開(kāi)。若不剪開(kāi)骨外膜,即使花費(fèi)很多時(shí)間處理髕骨下組織,也很難將髕骨推開(kāi)同時(shí)會(huì)導(dǎo)致出血。暴露膝關(guān)節(jié)間隙后,用顯微鑷子拉開(kāi)髕骨下脂肪墊,剪斷前交叉韌帶即可。后縫合傷口,碘酒外涂抹。手術(shù)做完后注意鼠的復(fù)蘇,一般在鼠手術(shù)后將鼠放在40度左右的小電熱毯上,大概在術(shù)后10-30分鐘后鼠將復(fù)蘇。此時(shí),將鼠放回動(dòng)物房,前交叉韌帶切除(ACLT)模型建立成功。2,關(guān)節(jié)軟骨各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)首先我們通過(guò)HE和Safranin O and fast green染色來(lái)判斷關(guān)節(jié)軟骨大體的情況。關(guān)節(jié)從軟骨至骨基本結(jié)構(gòu)是：透明軟骨、鈣化軟骨、軟骨下骨生長(zhǎng)版、軟骨下骨、生長(zhǎng)板及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。透明軟骨與鈣化軟骨之間有一條tidemark線。以此tidemark線的上移與否可以判斷關(guān)節(jié)軟骨鈣化的情況。Safranin 0染色可以把關(guān)節(jié)軟骨染為紅色,骨為綠色。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中,關(guān)節(jié)軟骨退行性病變,會(huì)致使關(guān)節(jié)軟骨糖蛋白丟失,使軟骨著色變淺或者引起軟骨下骨的浸潤(rùn),有綠色骨組織出現(xiàn)。繼而我們通過(guò)免疫染色去檢測(cè)軟骨分子蛋白的變化來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證軟骨的變化情況。我們選用的指標(biāo)是Lubricin,(基質(zhì)金屬蛋白酶)MMP13及(膠原酶)Col X. Lubricin分布關(guān)節(jié)軟骨的表明。大量實(shí)驗(yàn)證明,很多關(guān)節(jié)組織都分泌Lubricin,包括關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、半月板細(xì)胞以及交叉韌帶細(xì)胞等。Lubricin主要作用為潤(rùn)滑膝關(guān)節(jié),減少膝關(guān)節(jié)的摩擦力及滑膜等組織對(duì)軟骨的浸潤(rùn)。在OA的進(jìn)展過(guò)程中,Lubricin的表達(dá)量將會(huì)降低。關(guān)節(jié)軟骨是有軟骨細(xì)胞、Ⅱ型膠原分纖維及糖蛋白等物質(zhì)組成。糖蛋白功能似“海綿”以吸收和釋放關(guān)節(jié)周圍的水分來(lái)適應(yīng)關(guān)節(jié)力學(xué)的變化。Ⅱ型膠原纖維構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的骨架蛋白。正常狀態(tài)下,膝關(guān)節(jié)承受著正常的生理狀態(tài)下的力學(xué)刺激,關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行正常的應(yīng)力刺激去分泌Lubricin、Ⅱ型膠原纖維及糖蛋白去維持關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)穩(wěn)定。然而當(dāng)在創(chuàng)傷等條件下,膝關(guān)節(jié)將承受異常的力學(xué)刺激,關(guān)節(jié)軟骨在異常的力學(xué)刺激將會(huì)發(fā)生復(fù)雜的分子生物學(xué)的變化,將會(huì)減少Lubricin及糖蛋白等的分泌。同時(shí)增加MMP13及Col X的分泌。MMP13主要裂解Ⅱ型膠原纖維以破壞關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)。Col X是關(guān)節(jié)軟骨肥大的指標(biāo),也是軟骨破壞的指標(biāo)。最后我們用Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Mankin scores來(lái)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度給以量化評(píng)價(jià)。在評(píng)價(jià)量表中,總分等于等級(jí)乘以階段(score=grade x stage)。等級(jí)共分為6個(gè)等級(jí),第一個(gè)等級(jí)是關(guān)節(jié)表面是完整的(surface intact):在軟骨表層可能伴隨細(xì)胞的增生和壞死,但是軟骨中下層沒(méi)有波及到；第二個(gè)等級(jí)是表層不連續(xù)(surface discontinuity):表層軟骨伴灶性原纖維形成,并可能延伸至中層軟骨,在中層軟骨里可能伴有細(xì)胞的增生和死亡；第三個(gè)等級(jí)是垂直裂紋從軟骨表層延伸至中層(vertical fissures extending to mid-zone):同時(shí)侵入到中層的原纖維更多,并可能伴有裂紋延伸至軟骨底層；第四個(gè)等級(jí)是侵蝕(erosion):可以觀察到關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的丟失,基質(zhì)丟失的主要區(qū)域正在裂紋附近；第五個(gè)等級(jí)是裸露(denudation):鈣化的軟骨或軟骨下骨直接暴露出來(lái),微骨折見(jiàn)空隙可能被修復(fù)性的纖維軟骨所占據(jù)；第六個(gè)等級(jí)是變形(deformation):較多的微骨折及修復(fù)性的纖維軟骨,改變了整個(gè)關(guān)節(jié)軟骨的輪廓。同時(shí)將OA的進(jìn)程分為四個(gè)階段。每個(gè)階段意味著被破壞的關(guān)節(jié)面占整個(gè)關(guān)節(jié)面的比例,與OA的等級(jí)無(wú)關(guān)。第一個(gè)階段表明受損的軟骨占總軟骨表明的10%；第二個(gè)階段表明約占10%-25%；第三個(gè)階段為25%-50%；第四個(gè)等級(jí)表明軟骨表面損傷的面積超過(guò)總軟骨表面的50%。我們以等級(jí)與階段的乘積作為每個(gè)標(biāo)本的最終評(píng)分。3,軟骨下骨各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)首先我們使用三維micro-CT掃描骨組織結(jié)構(gòu)來(lái)測(cè)骨微觀結(jié)構(gòu)的變化情況。我們將老鼠吸入麻醉安樂(lè)死(Forane),去鼠膝關(guān)節(jié)包括股骨下段和脛骨上段。后用10%福爾馬林固定膝關(guān)節(jié)24小時(shí)(10% buffered formalin phosphate),后將10%福爾馬林更換為1x PBS。標(biāo)本使用高分辨率的三維CT掃描機(jī)掃描(SkyScan 1172),掃描后用三維CT重建軟件對(duì)標(biāo)本進(jìn)行三維重建(NRecon v1.6),并使用分析軟件對(duì)重建的三維CT掃描重建數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(CTAn v1.9 and CTVol v2.0)。我們將對(duì)軟骨下骨的下列指標(biāo)進(jìn)行分析：總組織體積包括松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨(TV);骨體積在同體積中所占有的量(BV/TV);松質(zhì)骨厚度(Tb.Th),松質(zhì)骨數(shù)量(Tb.N),松質(zhì)骨分離度(Tb.Sp),連接密度(connectivity density),軟骨下骨板厚度(SBP.Th)以及松質(zhì)骨模式因子(trabecular pattern factor)。同時(shí)我們也對(duì)軟骨下骨的骨重塑進(jìn)行檢測(cè)。我們用免疫染色的方法染色軟骨下骨TRAP及Osterix的變化情況。TRAP主要反映軟骨下骨破骨細(xì)胞變化情況,即骨吸收；Osterix是成骨細(xì)胞的標(biāo)記mark,反映的是軟骨下骨的骨形成。當(dāng)我們將鼠膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷(ACLT)后,鼠膝關(guān)節(jié)將承受異常的力學(xué)刺激。增強(qiáng)的力學(xué)刺激會(huì)影響軟骨下骨的骨重塑(bone remodeling),從而影響軟骨下骨骨吸收(bone resorption)及骨形成(bone formation)的變化。(二)常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨Th17細(xì)胞的影響1,檢測(cè)Th17細(xì)胞在軟骨下骨的變化情況我們首先通過(guò)免疫染色來(lái)確定軟骨下骨Th17細(xì)胞的變化。Th17屬于CD4+的免疫T細(xì)胞,其分泌IL17來(lái)發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)中常采用CD4+IL17+雙染陽(yáng)性細(xì)胞來(lái)定義Th17細(xì)胞。我們認(rèn)為在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展的早期,即在鼠的前交叉韌帶被切斷的早期,膝關(guān)節(jié)因承受異常的力學(xué)刺激,而引起局部炎癥反應(yīng)。T細(xì)胞會(huì)滲透至軟骨下骨內(nèi)。滲透過(guò)來(lái)的T細(xì)胞會(huì)在軟骨下骨微環(huán)境下分化為Th17細(xì)胞,因?yàn)楣芍厮苓^(guò)程中會(huì)釋放出骨基質(zhì)中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-p,而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-P是Th17細(xì)胞分化的必須物質(zhì)。鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本被三維CT掃描以后,放于脫鈣液中3-4周進(jìn)行脫鈣(10% EDTA)。后石蠟包(paraffin)或者冰凍包埋(OTX:optional cutting temperature)。組織切片時(shí)切片厚度為4微米。同時(shí)我們使用流式細(xì)胞(flow cytometry)進(jìn)一步驗(yàn)證Th17細(xì)胞的變化。我們?nèi)ダ鲜蟮墓撬韬屯庵苎�。老鼠給予吸入麻醉(forane),外周血采用心臟抽血的方法,每只鼠約600-1000微升。取骨髓通過(guò)將長(zhǎng)骨兩端剪開(kāi),使用注射器沖洗。后將骨髓及外周血按相應(yīng)處理進(jìn)行流式細(xì)胞分析。除此之外,我們進(jìn)一步做了術(shù)后不同時(shí)間段Th17含量的變化。我們?nèi)⌒g(shù)后2周和1個(gè)月作為時(shí)間點(diǎn)去驗(yàn)證Th17的變化是否隨時(shí)間的變化而變化。2,檢測(cè)軟骨下骨RANKL量的變化我們采用免疫熒光染色的方法去定量軟骨下骨RANKL含量。RANKL是破骨細(xì)胞分化的必須物質(zhì)。在軟骨下骨的微環(huán)境中,Th17將分泌IL17因子作用于軟骨下骨的成骨細(xì)胞上,成骨細(xì)胞將分泌RANKL作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成而促進(jìn)骨吸收。即為軟骨下骨在異常應(yīng)力刺激下進(jìn)行異常骨重塑的先決條件。(三)常山酮對(duì)軟骨下骨MSCs細(xì)胞TGF-β介導(dǎo)的smad2/3信號(hào)通路的影響1,體外培養(yǎng)MSCs, Western Blot觀察常山酮對(duì)TGF-β通路的影響我們從Texas AM Health Science Center College of Medicine Institute獲得GFP標(biāo)記的成年鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs。細(xì)胞傳至3-5代獲得我們所需要的細(xì)胞量一部分進(jìn)行試驗(yàn)一部分液氮凍存。培養(yǎng)基為Iscove's modified Dulbecco's medium (Invitrogen),輔以10% FCS (Atlanta Biologicals)、10%馬血清(Thermo Scientific)以及1%青霉素-鏈霉素溶液(Mediatech)。細(xì)胞被培養(yǎng)在6孔板上,細(xì)胞的密度為1.8×105/每孔。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后,提前予以添加常山酮(sc-211579, Santa Cruz Biotechnology)預(yù)處理4小時(shí)、8小時(shí)及12小時(shí)。于添加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β (RD Systems)前,饑餓細(xì)胞4小時(shí)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β與細(xì)胞作用30分鐘。后提取蛋白,每孔加200微升的細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑的混合溶液。所有操作在冰上進(jìn)行。提取完蛋白后,將放于蛋白的試管放于冰中1小時(shí),每10分鐘震蕩一次。后離心,13.2×103rpm,4度,10分鐘。將離心后的蛋白定量。后取適度的蛋白的與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)混合,100度水浴5-10分鐘。蛋白電泳跑膠,首先配膠。10%下層膠(2塊)：5.99毫升dd H2O、3.8ml PH8.8的下層膠緩沖液、5.01ml 30%ACR、224微升10% APS及10微升TEMED.8%上層膠(2塊)：4毫升dd H2O、1.77ml PH6.8的下層膠緩沖液、1.2ml 30% ACR、112微升10%APS及10微升TEMED.將蛋白加樣,60伏2-3小時(shí)。后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。后洗3遍,5分鐘每次,5%milk封閉1小時(shí),加入一抗4度過(guò)夜。第二天,取出放在室溫下20-30分鐘,回收一抗。有洗液洗6遍,10分鐘每次。加入二抗室溫下1小時(shí),后洗6遍,10分鐘每次。后暗室內(nèi)顯色獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2,動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)免疫染色MSCs和磷酸化的smad2/3我們應(yīng)用免疫組化及免疫熒光的方法在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證常山酮對(duì)軟骨下骨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)通路的影響。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)通路的機(jī)制是細(xì)胞外的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β配體與細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體Ⅱ結(jié)合,后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體Ⅱ?qū)?dòng)員招募轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體Ⅰ,從而形成轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體復(fù)合物。受體復(fù)合物繼而誘導(dǎo)smad2/3磷酸化,磷酸化的smad2/3將于smad4結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)而轉(zhuǎn)至核內(nèi),轉(zhuǎn)至核內(nèi)的smad2/3和smad4的復(fù)合物將于相應(yīng)基因結(jié)合,促進(jìn)或抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而發(fā)揮其作用。免疫組化染色psmad2/3。實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物被執(zhí)行安樂(lè)死后,我們?nèi)∈笫中g(shù)組及對(duì)照組的膝關(guān)節(jié)包括股骨下段和脛骨上段。先將膝關(guān)節(jié)固定24小時(shí),三維CT掃描后更換為脫鈣液(10% EDTA)脫鈣3-4周。后將組織石蠟包埋,切片。切片厚度為4微米。切好的片子放于56度半小時(shí),后保存于4度。染片時(shí),前一天將片放于65度過(guò)夜。第二天,取出放于室溫20-30分鐘。依次過(guò)zylene3遍、100%酒精2遍、95%酒精及80%酒精。標(biāo)本TBST洗3遍,5分鐘每次。同時(shí)配制1x抗原修復(fù)液預(yù)熱于65度,將標(biāo)本加入65度1x抗原修復(fù)液20分鐘,后轉(zhuǎn)至99.9度20分鐘,后室溫20分鐘。倒掉抗原修復(fù)液,TBST洗3遍,5分鐘每次。封閉筆花圈,加0.6%過(guò)氧化氫(H202)封閉10分鐘。TBST沖洗,5分鐘后再次沖洗放5分鐘。后加3%BSA封閉1小時(shí)。配制一抗,加一抗4度過(guò)夜。第二天,拿出標(biāo)本室溫下放置20分鐘。TBST洗滌3次,15分鐘每次。加入二抗,室溫放置1小時(shí)。TBST洗三次,每次15分鐘。DAB顯色,注意把握時(shí)間。復(fù)染細(xì)胞核(Hemotoxylin)約5-8秒。龍頭水沖洗一次。醋酸(acetic acid)5秒,后氨水(ammonia water)約1分鐘。一次過(guò)95%酒精、100%酒精兩次及xylene3次。封片,照片采集。4度保存。(四)常山酮對(duì)軟骨下骨異常血管形成的影響1,血管造影我們采用基于三維CT的血管造影來(lái)檢測(cè)在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程軟骨下骨血管的變化情況。方法是當(dāng)給予鼠安樂(lè)死后,打開(kāi)胸腔找到有心室用針尖扎個(gè)孔,或用剪刀剪破。后從左心室進(jìn)針沖洗整個(gè)體循環(huán)。首先給予20m1100u/ml的肝素(heparin)沖洗,預(yù)防并避免體循環(huán)內(nèi)凝血。后給予20m1的10%的福爾馬林(10% buffered formalin phosphate)固定。再以一定配比給予造影劑,可見(jiàn)肝臟明顯變黃。造影劑盡量每次只配一只老鼠的量,因其容易凝固而致浪費(fèi)。后將老鼠放置4度1到2天,然后解剖得到膝關(guān)節(jié)標(biāo)本,并放于福爾馬林里固定24小時(shí)。放于脫鈣液中脫鈣(10% EDTA)3-4周。三維CT掃描,獲得血管造影CT圖片。后用CT分析軟件分析所得到的數(shù)據(jù)(CTAn v1.9 and CTVol v2.0).2,免疫熒光染色CD31及Endomucin驗(yàn)證軟骨下骨血管情況我們通過(guò)使用免疫熒光染色進(jìn)一步驗(yàn)證軟骨下骨血管形成情況。我們使用免疫熒光雙染CD31及Enmucin來(lái)確定H型血管(CD31+ Endomucin+)的變化。H型血管(CD31+ Endomucin+)是一種特殊類型的血管,他只出現(xiàn)在骨系統(tǒng)中,在其他系統(tǒng)或組織中陰性。同時(shí)在骨系統(tǒng)中,H型CD31+ Endomucin+血管只出現(xiàn)在骨形成時(shí)期,即此血管主要作用是偶聯(lián)血管形成和骨的形成。血管形成可以為骨的形成提供所必須的MSCs和EPCs,同時(shí)也為骨提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及排除細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的廢物和垃圾。免疫熒光染色方法是將老鼠安樂(lè)死后,取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本包括股骨下段和脛骨上段。同時(shí)將標(biāo)本固定24小時(shí)后,脫鈣3-4個(gè)星期。后冰凍包埋(OTX:optional cutting temperature),-80度保存。冰凍切片時(shí)標(biāo)本厚度為0.4微米。后將標(biāo)本放于室溫1-2小時(shí)。染色時(shí)不用像免疫組化那樣將標(biāo)本提前放56度過(guò)夜。冰凍染色只需當(dāng)天拿出標(biāo)本放于室溫1小時(shí)：室溫20分鐘,40度20分鐘,后室溫再20分鐘。后用TBST洗3次。抗原修復(fù)液修復(fù)：現(xiàn)將抗原修復(fù)液預(yù)熱至65度,后將標(biāo)本放于65度抗原修復(fù)液中20分鐘,后99度20分鐘。放置室溫下20-30分鐘。將修復(fù)液倒掉,TBST洗3遍,5分鐘每次。放于濕盒內(nèi),吸干花圈。加入3%BSA封閉1個(gè)小時(shí)。后加入一抗4度過(guò)夜。第二天,取出標(biāo)本,放于室溫下20-30分鐘。TBST洗3次,15分鐘每次。加入二抗,室溫下放置1小時(shí)。注意此是熒光染色,加入二抗后一定要注意避光,蓋上一層錫紙放于室溫?fù)u床上1小時(shí)。后TBST洗3遍,每遍15分鐘。因此是免疫雙染,因同時(shí)加入兩個(gè)一抗是容易相互發(fā)生反應(yīng),使結(jié)果不準(zhǔn)確,我們多采取分次加入一抗。此時(shí),洗過(guò)后,再次用3% BSA封閉1小時(shí),加入第二個(gè)一抗1小時(shí),4度過(guò)夜。第二天取出步驟同上,再次加入第二個(gè)二抗,同樣避光放于室溫1小時(shí)。后TBST洗3遍,15分鐘每次。最后DAPI封片,顯微鏡下采集照片。定量計(jì)數(shù)。分析數(shù)據(jù)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1,常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨及關(guān)節(jié)軟骨的影響我們發(fā)現(xiàn)常山酮緩解了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。HE染色顯示在非常山酮治療組中關(guān)節(jié)軟骨的tidemark線上移,而常山酮治療抑制了這一現(xiàn)象。Tidemark線將關(guān)節(jié)軟骨分割為上方的透明軟骨和下方的鈣化軟骨。Tidemark線的上移表明鈣化軟骨的增多,意味著關(guān)節(jié)軟骨的破壞增加。常山酮抑制了Tidemark線的上移,意味著常山酮保護(hù)了關(guān)節(jié)軟骨。Safranin O染色進(jìn)一步表明常山酮治療緩解了關(guān)節(jié)軟骨表面糖蛋白的降解。Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Mankin scores在三組動(dòng)物中有顯著差異(F=136.360,P0.001)。與安慰劑治療組相比,常山酮組老鼠的OARSI分值顯著降低(P0.001)。我們進(jìn)一步通過(guò)免疫染色,骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中,Lubricin, MMP-13及Col X等分子的表達(dá)發(fā)生改變,lubricin表達(dá)在三組動(dòng)物中有顯著差異(F=49.603,P0.001),其中骨性關(guān)節(jié)炎組較對(duì)照組顯著降低,降低意味關(guān)節(jié)間的摩擦力增加,關(guān)節(jié)破壞增加；MMP-13和CoL X的表達(dá)在三組間均有顯著性差異(F=26.361, P0.001; F=109.328, P0.001),而與對(duì)照組相比,骨性關(guān)節(jié)炎組MMP-13和Col X的表達(dá)增加,MMP-13可以降解關(guān)節(jié)軟骨中的Ⅱ型膠原纖維,而Col X表明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的肥大,都表明軟骨的破壞增加。我們前期臨床結(jié)果已表明,在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中,軟骨下骨過(guò)度的骨吸收釋放激活的過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β。過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β打破了原來(lái)軟骨下骨中正常的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β濃度梯度,從而將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs動(dòng)員誘導(dǎo)至骨髓腔形成異位骨島,而非將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)至骨吸收部位以偶聯(lián)骨吸收,最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)力學(xué)環(huán)境的環(huán)境的改變,誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)軟骨的破壞并最終發(fā)展成骨性關(guān)節(jié)炎。因此我們假設(shè)如果抑制了軟骨下骨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β的信號(hào)通路,將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs重新誘導(dǎo)至骨吸收表面以偶聯(lián)骨吸收,將會(huì)緩解骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。因此我們選擇了常山酮。常山酮以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)通路被臨床用于治療纖維化等疾病。與以前結(jié)果相吻合,我們發(fā)現(xiàn)老鼠前交叉韌帶(ACLT)被離斷后,軟骨下骨的骨微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,三維CT掃描表明,安慰劑治療組中鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的總組織量(TV)增加,軟骨下骨松質(zhì)骨模型因子(Tb.pf)增加,同時(shí)軟骨下骨板的厚度(SBP)減少,這些都表明軟骨下骨正常的骨重塑遭到破壞。我們通過(guò)進(jìn)一步的免疫染色驗(yàn)證軟骨下骨骨重塑的情況。TRAP染色表明安慰劑治療組軟骨下骨破骨細(xì)胞增多,意味著軟骨下骨的骨吸收增加。而常山酮抑制了軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量的增加。Osterix染色與TRAP染色一致,安慰劑治療組Osterix陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,且增加的Osterix陽(yáng)性細(xì)胞聚在軟骨下骨骨髓腔,而并沒(méi)有被招募到骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收。常山酮治療抑制了軟骨下骨Osterix陽(yáng)性細(xì)胞的增加,同時(shí)Osterix陽(yáng)性細(xì)胞位于骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收。所有數(shù)據(jù)表明常山酮通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨下骨骨重塑保護(hù)了關(guān)節(jié)軟骨不受破壞并最終抑制了骨性關(guān)節(jié)的發(fā)生。2,常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨Th17細(xì)胞的影響Th17細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL17來(lái)調(diào)控RANKL的分泌,來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的成熟和分化。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ颓闆r下,骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期,由于前交叉韌帶被切斷導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn),關(guān)節(jié)不穩(wěn)則引起關(guān)節(jié)應(yīng)力發(fā)生改變而導(dǎo)致異常應(yīng)力刺激。而引起關(guān)節(jié)的局部炎癥反應(yīng),如炎癥細(xì)胞的滲出,包括CD4陽(yáng)性的T細(xì)胞。同時(shí)由于軟骨下骨在骨重塑的情況下,會(huì)釋放活化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β以偶聯(lián)骨形成和骨吸收。同時(shí),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β也是CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞的必要條件。因此,軟骨下骨的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β為滲出的CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞的提供的了完美的環(huán)境。Th17細(xì)胞分化完成后,Th17細(xì)胞可以分泌IL17因子。IL-17主要作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞,促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞分泌RANKL。RANKL則會(huì)作用于破骨前體細(xì)胞,促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的成熟并最終分化破骨細(xì)胞去吸收骨質(zhì)。通過(guò)免疫熒光染色我們發(fā)現(xiàn),在前交叉韌帶離斷(ACLT)模型下,安慰劑治療組的軟骨下骨Th17的數(shù)量在術(shù)后2周顯著增高。而常山酮抑制了Th17的細(xì)胞的增多。我們進(jìn)一步確認(rèn)Th17細(xì)胞數(shù)量的升高是不是有時(shí)間依賴性。我們發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞的數(shù)量到達(dá)峰值后(2周),會(huì)隨著時(shí)間的繼續(xù)推移而數(shù)量下降。數(shù)據(jù)顯示在術(shù)后1個(gè)月,Th17細(xì)胞的數(shù)量回到正常的水平。同時(shí)我們采用流式細(xì)胞(flo wcytometry)的方法進(jìn)一步確認(rèn)在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期Th17細(xì)胞的變化情況。我們分別取鼠的骨髓和外周血。流式細(xì)胞結(jié)果與免疫熒光結(jié)果相似,我們發(fā)現(xiàn)在術(shù)后2周Th17細(xì)胞在骨髓中中顯著升高,這種增多同樣具有時(shí)間依賴性,在術(shù)后1個(gè)月時(shí),Th17細(xì)胞的數(shù)量又回到對(duì)照組的水平。但是,Th17細(xì)胞在外周血中的含量,無(wú)論是術(shù)后2周還是術(shù)后1個(gè)月,均沒(méi)有發(fā)生顯著性差異。同時(shí)我們應(yīng)用免疫熒光的方法定量RANKL在軟骨下骨的表達(dá)。如前所述,Th17細(xì)胞是通過(guò)分泌IL17因子作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞,以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞來(lái)分泌RANKL來(lái)最終促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟及骨吸收。因此我們免疫熒光染色RANKL去驗(yàn)證是否軟骨下骨Th17伴隨著RANKL含量的增加。我們發(fā)現(xiàn),安慰劑治療組軟骨下骨RANKL的表達(dá)膠對(duì)照組顯著增加,同時(shí)常山酮的抑制了RANKL的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明,常山酮可以抑制軟骨下骨的骨吸收通過(guò)抑制Th17的分化及其所誘導(dǎo)的RANKL配體含量的表達(dá)。3,常山酮對(duì)軟骨下骨MSCs細(xì)胞TGF-β介導(dǎo)的smad2/3信號(hào)通路的影響骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生,是基于關(guān)節(jié)受到異常的力學(xué)刺激,引起關(guān)節(jié)軟骨釋放激活過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β,過(guò)多轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β破壞了原來(lái)關(guān)節(jié)內(nèi)的溶度梯度,從而將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs誘導(dǎo)至骨髓腔形成異位骨島從而誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。正常受力情況下,關(guān)節(jié)軟骨下骨進(jìn)行著正常的骨重塑,即破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì),同時(shí)激活釋放儲(chǔ)存在骨基質(zhì)中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),激活smad2/3通路TGF-β通路,從而將作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)誘導(dǎo)至骨吸收表面,以偶聯(lián)骨吸收和骨形成。然而在鼠膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶被切斷的情況下,關(guān)節(jié)承受著異常的力學(xué)刺激,導(dǎo)致過(guò)多的骨吸收同時(shí)釋放過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-p,因此激活了過(guò)多的MSCs的smad2/3通路。使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs在骨髓腔內(nèi)被原位激活,從而誘導(dǎo)了異位骨島在軟骨下骨的形成。我們?nèi)旧l(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs在安慰劑治療組鼠軟骨下骨內(nèi)顯著增加,且增加的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs位于軟骨下骨骨髓腔內(nèi),而不是位于骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收和骨形成。同時(shí),常山酮抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的數(shù)目的增加,并且將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs重新誘導(dǎo)至骨吸收表面去偶聯(lián)骨形成。為了進(jìn)一步去驗(yàn)證轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β是直接作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs,激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs內(nèi)的TGF-β通絡(luò),誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞內(nèi)smad2/3磷酸化。我們做了體外細(xì)胞培養(yǎng)及Western blot實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面,TGF-β可以直接激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs內(nèi)的TGF-β通路誘導(dǎo)smad2/3磷酸化。然而若提前給予細(xì)胞常山酮處理,將會(huì)降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的smad2/3的磷酸化。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),常山酮對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的smad2/3磷酸化的抑制具有時(shí)間和劑量依賴性。smad2/3的磷酸化會(huì)隨著劑量的不斷增大而減少,當(dāng)劑量達(dá)到1000nM時(shí),smad2/3的磷酸化被完全抑制。同時(shí),當(dāng)我們?cè)黾映Ｉ酵淖饔脮r(shí)間時(shí),對(duì)smad2/3的磷酸化的抑制強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)上進(jìn)一步驗(yàn)證了常山酮對(duì)smad2/3磷酸化通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)鼠行前交叉韌帶離斷術(shù)后(ACLT),軟骨下骨的psmad2/3顯著增加。給予常山酮治療顯著降低了psmad2/3的含量(F=8307.104,P0.001))。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,常山酮可以直接作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs,抑制MSCs的TGF-β信號(hào)通路,抑制smad2/3的磷酸化。從而調(diào)節(jié)了軟骨下骨未偶聯(lián)的骨重塑,并最終延緩了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展。4,常山酮對(duì)軟骨下骨異常血管形成的影響軟骨下骨的異常血管形成對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生至關(guān)重要。骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中,軟骨下骨血管的數(shù)量和體積均增加。異位骨島的形成在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中的作用至關(guān)重要。血管為骨島的形成提供所必須的MSCs,同時(shí)也為骨組織提供必需的氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。我們通過(guò)基于三維CT的血管造影的發(fā)現(xiàn),在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中,軟骨下骨的血管數(shù)量和總量均增加。同時(shí)常山酮抑制或減少了軟骨下骨血管的體積和數(shù)量。骨的形成總是伴隨著血管的生成。H型血管,是最近剛被篩選出來(lái)的一種只出現(xiàn)在骨組織的血管,且只在骨形成的過(guò)程中,即這種H型血管偶聯(lián)了骨的形成和血管的形成。這種血管以雙染CD31和Endomucin均陽(yáng)性為特征(CD31+ Endomucin+)。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中,異常的骨質(zhì)增生即異常的異位骨島形成在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中起了重要的作用。軟骨下骨異位骨島改變了關(guān)節(jié)內(nèi)的受力環(huán)境,使軟骨經(jīng)受異常的力學(xué)刺激,而引起關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞及軟骨的退行性病變。CD31+ Endomucin+血管是一種特異的偶聯(lián)骨形成的血管。因?yàn)槲覀冋J(rèn)為在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中,軟骨下骨異位骨島的形成伴隨著CD31+ Endomucin+血管的形成,因其偶聯(lián)骨形成。因此我們做了免疫雙染。免疫結(jié)果顯示,前交叉韌帶離斷術(shù)后(ACLT),鼠軟骨下骨CD31+ Endomucin+血管的數(shù)量明顯增加,同時(shí),常山酮抑制了CD31+Endomucin+血管的生成。這種抑制可能是由于常山酮抑制了TGF-β信號(hào)通路,從而減少了MSCs細(xì)胞的動(dòng)員和招募,MSCs可以和內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)相互作用以促進(jìn)骨形成。同時(shí)我們?cè)谠囼?yàn)中還發(fā)現(xiàn),常山酮除了抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-p的信號(hào)通路外,在抑制血管形成的作用中,常山酮還抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。我們發(fā)現(xiàn),安慰劑治療組的鼠軟骨下骨內(nèi)皮細(xì)胞的增生明顯增加,而常山酮組軟骨下骨內(nèi)皮細(xì)胞的增生與對(duì)照組相似,意味著常山酮抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)常山酮抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)的活性�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)是在血管形成中研究較多的一種蛋白酶,主要作用血管基底膜的Ⅳ型膠原纖維,裂解Ⅳ型膠原纖維以促進(jìn)新生血管形成。我們發(fā)現(xiàn)安慰劑治療組基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)的含量明顯增高,而常山酮明顯降低了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)了含量。綜上所述,常山酮可以通過(guò)抑制異常血管的形成來(lái)調(diào)節(jié)軟骨下骨的骨重塑并最終緩解骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。四、結(jié)論1,常山酮緩解了關(guān)節(jié)軟骨的破壞從而延緩了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生,這一作用是通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨下骨的異常的骨重塑抑制軟骨下骨異位骨島的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的；2,常山酮抑制了軟骨下骨Thl7細(xì)胞從而減少了軟骨下骨異常增多的骨吸收進(jìn)而減少了過(guò)多的活性的TGF-p的釋放；3,常山酮抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的TGF-β依賴的smad2/3信號(hào)通路。4,常山酮抑制了軟骨下骨異常的血管形成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5

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6 武W毶，

本文編號(hào)：1453304