本文關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脊髓損傷大鼠血脊髓屏障的影響及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景和目的：脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)疾病,常常導(dǎo)致嚴(yán)重的或永久性殘疾。不僅給病人帶來巨大的痛苦,也給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。近年來,脊髓損傷的修復(fù)和治療一直是世界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),其主要原因是脊髓損傷后復(fù)雜的病理生理機(jī)制。脊髓損傷的病理生理過程主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段。脊髓損傷后血管和神經(jīng)組織機(jī)械性的破壞和斷裂引起原發(fā)性損傷,繼發(fā)性損傷主要涉及一系列復(fù)雜的分子級聯(lián)事件,包括脊髓出血、水腫、細(xì)胞內(nèi)外離子失衡、血管異常、缺血再灌注、脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性中毒和炎癥反應(yīng)等,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡以及膠質(zhì)瘢痕形成,阻礙軸突再生,進(jìn)一步降低組織自我修復(fù)能力。其中炎癥反應(yīng)在脊髓繼發(fā)性損傷中扮演了重要角色。脊髓損傷后血管的直接損害或炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致血脊髓屏障(Blood spinal cord barrier, BSCB)受到破壞,BSCB的破壞又引起一系列滲透性的改變,包括脊髓出血、水腫和炎癥反應(yīng),產(chǎn)生和分泌大量的毒性因子,啟動氧化應(yīng)激,導(dǎo)致組織水腫加重,嚴(yán)重影響患者預(yù)后。緊密連接(Tight junction, TJ)蛋白是維持BSCB功能最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)之一,而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的表達(dá)與活性變化可能是導(dǎo)致細(xì)胞緊密連接蛋白分子元件異常變化及屏障破壞的一個重要機(jī)制。目前,臨床上對SCI的治療主要包括早期手術(shù)治療(脊髓受壓節(jié)段椎管減壓術(shù))、藥物治療(激素沖擊療法、脫水及神經(jīng)營養(yǎng)藥物等)以及后期的康復(fù)治療。雖然這些治療方法有一定的效果,但仍會遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙和殘疾。因此,急需尋找一種新的治療方法來促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。近年來干細(xì)胞移植治療脊髓損傷被認(rèn)為是一個潛在的治療方法。多種類型的細(xì)胞,如胚胎干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,已被用于脊髓損傷治療的研究。但目前為止適用于臨床研究和開發(fā)的種子細(xì)胞依然較少,其主要問題為：細(xì)胞來源有限、細(xì)胞移植后存活率低、免疫排斥反應(yīng)、倫理學(xué)問題、致瘤性等。因此,選擇合適的種子細(xì)胞,提高移植細(xì)胞存活率以及深入了解移植細(xì)胞的作用機(jī)制對于脊髓損傷患者的治療顯得尤為重要。大量文獻(xiàn)表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)可以向多個胚層組織分化,在適當(dāng)條件下可分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞等。而且,與其他來源的干細(xì)胞相比,ADSCs具有組織來源廣泛、易于獲取和體外培養(yǎng)擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為近年來干細(xì)胞移植的種子細(xì)胞。大量研究表明,ADSCs移植可減少脊髓繼發(fā)性損傷,促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)。其機(jī)制可能與分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、減輕炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡和膠質(zhì)瘢痕的形成、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生等有關(guān)。但是,關(guān)于ADSCs對脊髓損傷大鼠BSCB功能的影響及相關(guān)機(jī)制的研究尚未見報道。因此,本實(shí)驗(yàn)采用大鼠ADSCs移植來治療大鼠脊髓損傷,探究其對BSCB功能的影響及其可能機(jī)制,為臨床上脊髓損傷患者的治療提供新的思路。方法：1、大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的收集、培養(yǎng)及流式細(xì)胞鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志。2、選取健康的成年雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat),采用鉗夾法建立大鼠T10脊髓損傷模型。將造模成功的SD大鼠進(jìn)行分組：假手術(shù)組、脊髓損傷組、細(xì)胞移植組。細(xì)胞移植組脊髓損傷后立即用Hamilton微量注射器將鑒定過的濃度為1×105/μ1的10μ1細(xì)胞沿?fù)p傷中心頭尾端緩慢注入。脊髓損傷組在脊髓損傷后相同時間點(diǎn)相同部位注射等量的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS),假手術(shù)組僅行椎板切除,不損傷脊髓。3、行為學(xué)評定：術(shù)前3天及術(shù)后1、3、5、7、10、14天采用BBB(Basso-Beattie-Bresnahan, BBB)評定功能量表對所有大鼠后肢運(yùn)動功能進(jìn)行評分。4、脊髓組織含水量的檢測：通過干濕重法對脊髓組織水腫進(jìn)行檢測。術(shù)后第1、3、5、7天大鼠麻醉后斷頭取脊髓,以損傷點(diǎn)為中心取出約1cm的脊髓組織進(jìn)行水腫檢測,使用電子天平稱其濕重。將脊髓組織放入80℃烤箱內(nèi)烘烤72 h后,再次用電子天平稱其干重。脊髓組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]x 100%。5、血脊髓屏障通透性的測定：通過伊文思藍(lán)對血脊髓屏障通透性進(jìn)行檢測。術(shù)后第3天將大鼠麻醉,股靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液(4 ml/kg),1h后用生理鹽水行心臟灌注斷頭取脊髓。取損傷中心約1 cm的脊髓組織,稱其濕重后加入2 ml 50%三氯乙酸,37℃孵育72h。充分研磨后14 000 r/min離心20 min。取1ml上清與3 ml無水乙醇混合。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀(參數(shù)設(shè)定：激發(fā)波長620nm、發(fā)射波長680 nm)測定熒光強(qiáng)度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各脊髓組織伊文思藍(lán)含量,測得的結(jié)果用ug/g脊髓組織表示。6、Western blot檢測蛋白表達(dá)變化術(shù)后第3天大鼠麻醉后快速斷頭取脊髓,取損傷中心約1 cm的脊髓組織。組織標(biāo)本經(jīng)勻漿、裂解、離心(12000 rpm,4℃,20 min)后,用蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育、顯影及定影。凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析ZO-1、Claudin-5和MMP-9蛋白表達(dá)變化。7、脊髓組織石蠟切片制作及HE染色術(shù)后第3天大鼠麻醉后,分別用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注。取損傷中心約1 cm的脊髓組織,4%多聚甲醛溶液浸泡12-24小時后,按照常規(guī)石蠟包埋方法制作成石蠟標(biāo)本并切片,切片厚度為3 gm。組織切片經(jīng)脫蠟、水化,蘇木素染色2 min,鹽酸酒精中分化數(shù)秒,伊紅溶液染色30s后顯微鏡下觀察、拍片、分析。8、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測。石蠟切片脫蠟和水化,檸檬酸緩沖液(PH=6.0)給予微波熱修復(fù),血清常溫封閉30 min, PBS溶液沖洗后滴加10 μl TUNEL反應(yīng)混合液,37℃避光孵育60min。熒光顯微鏡下觀察、拍照。9、免疫熒光石蠟切片脫蠟和水化,檸檬酸緩沖液(PH=6.0)中給予微波熱修復(fù),血清室溫封閉30 min后滴加一抗(兔抗MPO一抗、兔抗Iba-1一抗),4℃孵育過夜。PBS溶液沖洗后滴加相應(yīng)的熒光二抗(山羊抗兔-Alexa Fluor 488),37℃避光孵育1h。熒光顯微鏡下觀察、拍照。結(jié)果：1、細(xì)胞的生長、形態(tài)及鑒定：培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為圓形,大小不等,呈懸浮狀,其間混有大量紅細(xì)胞。靜置培養(yǎng)24 h,可見細(xì)胞開始貼壁,48 h后貼壁細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則多角形,隨著時間延長貼壁細(xì)胞不斷增多,細(xì)胞呈長梭形、有細(xì)小的突起。原代培養(yǎng)的細(xì)胞在1周左右融合達(dá)到80%-90%時可進(jìn)行傳代,此時細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀排列。傳代后細(xì)胞增殖速度很快,細(xì)胞純度較高。流式細(xì)胞儀檢測顯示CD29和CD90高表達(dá),分別為99.97%和99.04%,而CD45和CD49d低表達(dá),分別為2.37%和2.67%,符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的一般表達(dá)情況。2、行為學(xué)評定：術(shù)前所有大鼠的BBB評分均為21分,除假手術(shù)組外,脊髓損傷組和細(xì)胞移植組的大鼠后肢運(yùn)動功能在術(shù)后立即表現(xiàn)為完全性截癱,BBB評分為0。隨著時間延長,運(yùn)動功能逐漸恢復(fù),且同一時間點(diǎn)細(xì)胞移植組的BBB評分均高于脊髓損傷組。術(shù)后第5天開始,細(xì)胞移植組大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)較脊髓損傷組明顯,三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、脊髓組織含水量測定假手術(shù)組脊髓組織含水量基本保持不變,脊髓損傷組和細(xì)胞移植組含水量在第3天時達(dá)到高峰,此后含水量逐漸下降。同一時間點(diǎn)脊髓損傷組含水量均高于細(xì)胞移植組,損傷后第7天兩組脊髓組織含水量仍高于假手術(shù)組水平。造模后第1、3、5、7天,三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、血脊髓屏障功能檢測與假手術(shù)組相比,脊髓損傷后伊文思藍(lán)的滲出量明顯增加,提示脊髓損傷后BSCS通透性升高,而ADSCs移植可以緩解伊文思藍(lán)的滲出量。三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、Western blot檢測Western blot結(jié)果顯示術(shù)后第3天MMP-9蛋白在假手術(shù)組少量表達(dá),脊髓損傷后MMP-9表達(dá)明顯升高,而進(jìn)行干細(xì)胞移植可以明顯抑制MMP-9的表達(dá),三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ZO-1和Claudin-5的表達(dá)水平在假手術(shù)組最高,細(xì)胞移植組次之,脊髓損傷組最低,三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測我們通過TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡的情況。發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組細(xì)胞凋亡數(shù)最少,脊髓損傷組細(xì)胞凋亡數(shù)最多,而細(xì)胞移植組的細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于脊髓損傷組,三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7、免疫熒光檢測MPO的免疫熒光結(jié)果：假手術(shù)組基本未見陽性細(xì)胞表達(dá),脊髓損傷組陽性細(xì)胞表達(dá)最多,細(xì)胞移植組陽性細(xì)胞表達(dá)明顯低于脊髓損傷組,三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Iba-1的免疫熒光結(jié)果：假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞大部分處于靜止?fàn)顟B(tài),胞體小,有向各個方向的突起,呈分枝狀。脊髓損傷后,小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為突起回縮,胞體相對增大,但細(xì)胞移植組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞較脊髓損傷組少,三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8、HE染色HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織中灰白質(zhì)分界清楚,神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)纖維排列緊密、連續(xù),無出血、炎細(xì)胞浸潤及空洞形成。脊髓損傷組和細(xì)胞移植組大鼠脊髓組織均發(fā)現(xiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤、神經(jīng)纖維溶解、脊髓空洞和出血灶,但細(xì)胞移植組炎性細(xì)胞浸潤數(shù)目、神經(jīng)纖維溶解的程度、脊髓空洞的面積和出血灶的大小均小于脊髓損傷組。結(jié)論：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù),其機(jī)制可能通過抑制MPO的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,下調(diào)MMP-9,減少脊髓損傷后緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-5的缺失,減輕脊髓水腫和減少細(xì)胞凋亡,從而減輕血脊髓屏障的破壞,發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊迎暴,樸英杰;白藜蘆醇對大鼠脊髓急性損傷后繼發(fā)性損傷的影響(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2003年07期

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本文編號：1231624