本文關鍵詞：炎癥狀態(tài)下鋅指蛋白A20對牙髓干細胞增殖及分化能力的影響

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【摘要】：常見牙病(牙髓炎、根尖周炎)的實質是炎癥,牙髓炎主要繼發(fā)于齲病,致齲微生物及其產(chǎn)物可以通過暴露的髓腔或者牙本質小管間接感染牙髓。由于缺乏自愈能力,感染后的牙髓組織會引發(fā)炎癥反應,繼而變性或壞死,導致根尖周炎、牙齒缺失、牙槽骨缺損等繼發(fā)性疾病[1]。因此,設法增強牙齒及其周圍組織對炎癥的抵抗力,以及在炎癥狀態(tài)下的修復能力,對于牙齒的保存治療具有重要意義。鋅指蛋白A20是一種具有高度生物學活性的蛋白。作為NF-κB通路中的一個重要的負反饋調(diào)節(jié)因子,A20不僅能夠抑制NF-κB的活性,還能阻斷多種炎癥介質的釋放,因此在控制炎癥方面有很大的應用前景,但其在炎癥性牙病發(fā)生、發(fā)展、轉歸中的作用卻鮮見報道。人牙髓干細胞(hDPSCs)被認為是來源于牙髓組織的未分化間充質細胞,具備高度增殖能力、形成細胞克隆能力及多向分化潛能。DPSCs的發(fā)現(xiàn)讓我們對牙齒的發(fā)育、再生及其修復機制有了進一步認識,為開發(fā)新的牙病治療方法提供了新的思路。本研究擬通過RNA干擾技術,建立炎癥狀態(tài)下牙髓干細胞A20基因沉默的細胞模型,探討a20基因沉默對hdpscs增殖及分化能力的影響,為探索牙髓炎、根尖周炎的新療法打下理論基礎。實驗方法及結果如下:1、hdpscs的分離、培養(yǎng)及鑒定臨床上收集15-28歲成人健康完整第三磨牙,用組織塊酶消化法原代培養(yǎng)hdpscs,有限稀釋法挑取單細胞克隆并進行擴大培養(yǎng),通過流式細胞儀對細胞表面標志物進行檢測和鑒定,體外礦化誘導兩周后進行茜素紅染色以檢測細胞的分化潛能。實驗結果表明,成功分離培養(yǎng)出了具有良好的增殖能力及分化潛能的hdpscs。2、炎癥狀態(tài)下hdpscs中a20表達量的變化通過脂多糖lps刺激細胞,模擬體外的炎性環(huán)境,觀察lps刺激下牙髓干細胞中a20表達量的變化。用濃度為1ug/ml的lps刺激液培養(yǎng)細胞,分別在刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h后收集細胞,通過westernblot技術檢測hdpscs中a20的表達情況。結果顯示:在lps刺激2h時,a20的表達量即迅速增加并一直持續(xù)到48h,在72h時,a20的表達量已回到基礎水平。由此我們可以得出結論:在炎癥狀態(tài)下,a20的表達具有時效性,即在早期呈現(xiàn)一過性的高表達。3、a20基因沉默的hdpscs細胞模型的建立為了研究lps刺激下,a20基因沉默對hdpsc增殖及分化的影響,我們采用rna干涉技術構建a20基因沉默的細胞模型。參考相關文獻設計sirna的序列,并委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成。在預實驗中,我們對sirna的轉染條件進行了優(yōu)化,確保能夠實現(xiàn)最高的轉染效率。用對任何片段都不具有干涉作用的nc-sirna設為對照組,采用westernblot技術驗證a20-sirna的干涉效果,結果顯示a20的表達水平明顯下降,表明hdpscs中a20基因抑制的細胞模型的構建是成功的。4、炎癥狀態(tài)下a20基因沉默對hdpscs增殖能力的影響利用lps模擬體外的炎癥環(huán)境,用cck-8試劑盒研究在炎癥狀態(tài)下a20基因沉默對hdpsc增殖能力的影響。在sirna成功轉染hdpscs后,將細胞種于96孔板中,并加入lps刺激,分別于1、3、5、7天用酶標儀測定在450nm處的吸光度值,判定細胞的生長狀況。結果顯示,實驗組中hdpsc的生長狀況受到明顯抑制,與對照組相比有顯著性差異,表明A20基因沉默能夠顯著降低hDPSCs的增殖能力。5、炎癥狀態(tài)下A20基因沉默對hDPSCs分化能力的影響將轉染過siRNA的hDPSCs礦化誘導14天后進行茜素紅染色,發(fā)現(xiàn)實驗組礦化結節(jié)的數(shù)量明顯低于對照組,對以上染色結果進行定量分析后的數(shù)據(jù)顯示,該差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。對牙髓干細胞分化相關標志物堿性磷酸酶(ALP)的活性檢測顯示,與對照組相比,實驗組hDPSCs的ALP活性受到了明顯抑制。接著對牙髓干細胞的部分成骨/成牙相關基因ALP、DSPP、OCN、RUNX2的表達情況進行檢測,RT-PCR結果顯示,實驗組中這些基因的表達水平明顯低于對照組。以上結果提示:在炎癥狀態(tài)下,A20基因沉默能夠抑制hDPSC的分化能力。本研究通過體外實驗證明,鋅指蛋白A20在人牙髓干細胞具有一定的基礎表達水平,炎癥狀態(tài)下,A20的表達具有時效性,即在早期呈現(xiàn)一過性的高表達,而后維持基礎表達量,以維系hDPSCs的增殖和分化能力。通過RNA干涉技術對hDPSC中A20的表達進行了阻斷,導致其表達量低于基礎表達量后,發(fā)現(xiàn)A20基因沉默是hDPSCs對抗炎癥能力下降的重要原因,具體表現(xiàn)為其增殖能力及分化能力的下降。
【關鍵詞】：鋅指蛋白A20 人牙髓干細胞 脂多糖 增殖 分化
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-22
• 第一部分 人牙髓干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定22-29
• 1 實驗材料22-23
• 2 實驗方法23-25
• 3 實驗結果25-27
• 4 討論27-29
• 第二部分 炎癥狀態(tài)下HDPSCS中A20表達量的變化29-37
• 1 實驗材料29-31
• 2 實驗方法31-34
• 3 實驗結果34-35
• 4 討論35-37
• 第三部分 炎癥狀態(tài)下HDPSCS中A20基因沉默的細胞模型的建立37-45
• 1 實驗材料37-39
• 2 實驗方法39-40
• 3 實驗結果40-43
• 4 討論43-45
• 第四部分 炎癥狀態(tài)下A20基因沉默對HDPSCS增殖及分化能力的影響45-56
• 1 實驗材料45-46
• 2 實驗方法46-50
• 3 實驗結果50-53
• 4 討論53-56
• 小結56-58
• 參考文獻58-66
• 個人簡歷和研究成果66-67
• 致謝67

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本文編號：971768