本文關鍵詞：Cdc42對小鼠釉質發(fā)育影響的初步研究

  更多相關文章： 小鼠 成釉細胞 cdc42 釉基質蛋白

【摘要】：研究背景和目的在牙齒牙釉質的發(fā)育過程中,成釉細胞的功能十分重要。它既具有合成和分泌釉質基質的功能,又對其合成分泌的基質有重吸收以及降解的作用,同時它還和鈣鹽的轉運相關,因此成釉細胞是釉質形成過程中十分關鍵的細胞。當外界環(huán)境或者內(nèi)在營養(yǎng)、遺傳等因素發(fā)生變化時,都有可能導致成釉細胞的分化產(chǎn)生異常,從而會造成牙釉質不同程度的發(fā)育不全。為了明確釉質發(fā)育過程及其影響因素,許多國內(nèi)外學者針對成釉細胞的細胞學特性進行相關探索。在導致牙釉質結構異常的各種疾病原因中,由于遺傳因素而不涉及全身其他疾病的異常稱為遺傳性牙釉質發(fā)育不全(amelogenesis imperfecta,AI)。目前我國對觸的研究多局限于家族病例的報道,而國外學者對AI的病因進行了深入探索。對于導致趟的病因中,首先被確定的致病基因是編碼釉原蛋白的基因。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的釉原蛋白(AMELX),釉蛋白(ENAM),金屬基質蛋白酶20(MMP20)和絲氨酸蛋白酶4(KLK4)這四個致越基因的突變數(shù)目分別為15、9、4和1。但它們突變引起的舡僅占所研究越家族數(shù)目的四分之一,這說明還存在別的與趟發(fā)病相關基因[2]。很多學者也對此進行了相關研究。近來的研究開始圍繞著Rho介導的信號通路在釉質發(fā)生過程中發(fā)揮的潛在調(diào)節(jié)作用[捫。Rho蛋白屬于小G蛋白家族,是Ras超家族的亞家族成員。通常,我們根據(jù)Rho蛋白基因序列的同源程度和功能不同,可以將其分為RhoA、 Rac1、Cdc42及缺乏GTP酶活性等四大類。其中RhoA、Rac1、Cdc42經(jīng)常被學者們作為研究的重點。Rho蛋白在信號轉導過程中起主調(diào)控器的作用,大部分Rho蛋白快速轉換于與GTP結合和與GDP結合這兩種狀態(tài)之間,即活化狀態(tài)和非活化狀態(tài)。因此,它能夠在細胞的信號轉導過程中起到“分子開關”作用。它們在調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架方面起到舉足輕重的作用,同時顯著影響轉錄因子活性、膜運輸途徑、細胞極性和微管動力學。即它們參與調(diào)控細胞內(nèi)吞作用和胞外分泌、細胞形狀和細胞與細胞相互作用,以及調(diào)控細胞極性、細胞運動等生理過程[5,61。作為Rho蛋白家族的主要成員之一,細胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在與GTP結合時呈激活狀態(tài),反之與GDP相結合時則呈失活狀態(tài)。在與GTP結合時,Cdc42能夠激活其下游的效應因子,進而會導致一系列的細胞反應。研究顯示Cdc42在細胞生長、分化、程序化死亡、細胞極性的建立等方面起到重要作用,在細胞內(nèi)參與了許多重要的代謝調(diào)控過程。Cdc42能夠誘導偽足等的重建,并且使肌動蛋白多聚化和組裝[7],從而參與了細胞骨架的維持及重組。同時,有研究人員認為Cdc42是通過影響p21CIPI的功能從而參與調(diào)控錨定依賴性細胞的細胞周期[8],以及在細胞外因子刺激細胞引起的轉錄過程中發(fā)揮較重要作用。此外,Cdc42分子有助于細胞內(nèi)吞作用,常發(fā)生于一些特殊的微環(huán)境。目前,尚未發(fā)現(xiàn)有關Cdc42蛋白在牙齒發(fā)育過程尤其釉質發(fā)育過程中具體表達情況以及發(fā)揮作用的研究報道。因此,本實驗旨在明確Cdc42在小鼠牙齒發(fā)育過程中的具體表達,并且對其在小鼠成釉細胞中可能發(fā)生的作用進行初步探討。本論文分以下四個部分內(nèi)容：第一章：Cdc42在小鼠牙胚發(fā)育中的表達本實驗分別獲取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5的小鼠磨牙牙胚,經(jīng)過固定、脫水、透明、包埋蠟塊,最后得到組織切片。將組織切片進行HE染色和組織免疫熒光檢測。通過免疫熒光方法檢測整個牙胚發(fā)育包括蕾狀期、帽狀期、鐘狀期、鐘狀晚期等過程中Cdc42的表達情況,初步了解其在牙胚發(fā)育尤其釉質發(fā)育過程中都有不同程度的表達。第二章：小鼠成釉細胞離體培養(yǎng)、純化及鑒定本實驗通過酶消化法體外培養(yǎng)小鼠成釉細胞,縮短培養(yǎng)時間。以基底膜抽提物包被,利于細胞貼壁及生長。并通過差速消化法,可獲得純化的成釉細胞。其純度較高,有利于相關基礎研究的進行,為小鼠成釉細胞的體外培養(yǎng)及純化提供了思路。第三章：Cdc42在小鼠成釉細胞中的表達本實驗通過RT-PCR從mRNA水平證實了小鼠成釉細胞中Cdc42的存在,用Western blot從蛋白水平檢測了Cdc42在小鼠成釉細胞中的表達,最后通過免疫熒光進一步明確定位Cdc42主要表達于小鼠成釉細胞胞膜與胞質位置,為以后探討Cdc42在小鼠成釉細胞中所發(fā)揮生物學功能影響奠定了基礎。第四章：抑制Cdc42對小鼠成釉細胞釉基質蛋白表達的影響本實驗通過運用Cdc42抑制劑ML141培養(yǎng)小鼠成釉細胞,達到抑制細胞中Cdc42。再通過Western blot檢測小鼠成釉細胞中釉基質蛋白表達水平,從而初步探尋Cdc42對釉質發(fā)育過程可能發(fā)揮的作用。材料與方法小鼠牙胚切片的制作分別獲取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5組織標本。將標本置于4%多聚甲醛溶液中固定后,再通過50%、70%、80%、90%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%I、100%Ⅱ的乙醇溶液中按由低到高梯度濃度達到脫水目的。脫水完成的標本放入二甲苯中透明,再置于60℃的蠟中浸蠟。浸蠟后的組織按照切片需要方向包埋出蠟塊。石蠟切片機上5 μm連續(xù)切片,撈片放入烤箱備用。HE染色將組織切片浸入二甲苯中脫蠟,之后依次經(jīng)過由低到高梯度濃度乙醇溶液復水。蘇木精染核,鹽酸酒精溶液分化脫色,流水返藍,鏡下觀察至合適深度后浸入伊紅溶液中染色。復染好的組織切片再次經(jīng)過脫水透明步驟,最后樹膠封片,正置顯微鏡下觀察。組織免疫熒光將組織切片浸入二甲苯中脫蠟,之后依次經(jīng)過梯度濃度乙醇溶液復水。蒸餾水洗滌之后,運用枸櫞酸鈉溶液進行抗原熱修復。再通過BSA封閉液封閉非特異性抗原。一抗4℃孵育過夜,二抗及Hoechst避光室溫孵育后,熒光防淬滅甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。小鼠成釉細胞離體培養(yǎng)取新生小鼠脫頸處死浸泡于75%酒精中消毒后,沿上下頜骨中線將頭部分為上下兩部分,置于預冷無菌的D-Hanks溶液中清洗,于體視顯微鏡下完整分離上下頜中的第一磨牙牙胚。將牙胚收集加入0.25%含有EDTA的胰酶中,剪碎并37℃消化20 mmin,每5 mmin鐘搖晃一次以促進胰酶作用均勻。將所得細胞懸液1000r/min離心5 mmin,棄去上清,用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,接種于用0.25 mg/mL Geltrex Matrix包被的培養(yǎng)皿中,置于37℃、50%C02飽和度和飽和濕度標準條件的孵箱中,隔天換液。小鼠成釉細胞純化利用上皮與間充質兩種細胞對胰蛋白酶耐受力的不同,取原代培養(yǎng)4d細胞,吸出培養(yǎng)基,用無菌的D-Hanks溶液清洗細胞后,加入0.25%胰蛋白酶,在倒置顯微鏡下觀察至長梭形成纖維樣細胞邊緣收縮,而上皮樣細胞并無明顯變化,此時加入培養(yǎng)基中止消化,并輕輕淋洗貼壁細胞,然后加入全培繼續(xù)培養(yǎng)。一周后重復差別消化,連續(xù)培養(yǎng)。細胞免疫熒光將細胞消化后并種植于細胞爬片上,培養(yǎng)1d后,用無菌的D-Hanks溶液清洗,4%多聚甲醛溶液室溫下固定10 min, PBS溶液清洗3次,每次5 mmin,0.1% TritonX-100孵育5 min后PBS清洗,5%的BSA室溫封閉1h,一抗(K14和AMELX)孵育4℃過夜,PBS洗3次,每次5一mmin,紅色熒光二抗室溫孵育1h, Hochest復染細胞核,最后用熒光防淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察。RT-PCR提取細胞總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA后,用PCR擴增儀進行擴增,并通過瓊脂糖凝膠電泳跑膠,放入激光成像系統(tǒng)中觀察。Western blot常規(guī)提取細胞的蛋白,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白的濃度,并將各樣品蛋白濃度調(diào)至相同。分別配好分離膠與濃縮膠、上樣、倒入電泳緩沖液進行電泳跑膠、轉膜、封閉、依次孵育一二抗、最后顯影液曝光,觀察記錄結果。統(tǒng)計學分析所有數(shù)值采用Mean±SD記錄,應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計分析,計量資料采用One Way ANOVA比較多組差異性,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.Cdc42在小鼠牙胚發(fā)育過程中的表達情況免疫熒光方法檢測到Cdc42在小鼠牙胚蕾狀期、帽狀期、鐘狀期及鐘狀晚期都有表達,在釉質發(fā)育過程中在成釉器中有不同程度的表達。2.小鼠成釉細胞的離體培養(yǎng)及純化原代培養(yǎng)的小鼠成釉細胞生長良好,其中混有大量成纖維樣細胞,經(jīng)改良純化后明顯好轉,細胞呈鋪路石樣成片生長,細胞純度較高。3.Cdc42在小鼠成釉細胞中的表達情況RT-PCR顯示Cdc42 mRNA在小鼠成釉細胞中表達,Western blot顯示Cdc42在小鼠成釉細胞中檢測到表達,細胞免疫熒光顯示Cdc42在小鼠成釉細胞中表達并定位于胞膜與胞質。4.抑制Cdc42對小鼠成釉細胞釉基質蛋白表達的影響運用Cdc42抑制劑ML141培養(yǎng)小鼠成釉細胞,達到抑制Cdc42的效果。通過Western blot檢測到小鼠成釉細胞釉基質蛋白有不同程度的變化。結論1.Cdc42在各階段小鼠牙胚尤其成釉器中有不同程度表達變化,表明Cdc42可能參與釉質發(fā)育過程。2.采用基底膜抽提物作為基質,酶消化法培養(yǎng)后經(jīng)差速消化法純化得到小鼠成釉細胞,有利于相關基礎研究的進行。3.小鼠成釉細胞中表達Cdc42,其主要表達于小鼠成釉細胞胞膜與胞質,提示Cdc42與成釉細胞有密切聯(lián)系。4.當Cdc42受到抑制,小鼠成釉細胞中AMELX、AMBN、MMP20以及KLK4都出現(xiàn)了不同程度的變化,提示Cdc42可能影響小鼠成釉細胞釉基質蛋白的表達情況。
【關鍵詞】：小鼠 成釉細胞 cdc42 釉基質蛋白
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-20
• 第一章 Cdc42在小鼠牙胚發(fā)育中的表達20-28
• 1. 材料與方法20-23
• 2. 結果23-26
• 3. 討論26-28
• 第二章 小鼠成釉細胞離體培養(yǎng)、純化及鑒定28-37
• 1. 材料與方法28-32
• 2. 結果32-35
• 3. 討論35-37
• 第三章 Cdc42在小鼠成釉細胞中的表達37-47
• 1. 材料與方法37-43
• 2. 結果43-44
• 3. 討論44-47
• 第四章 抑制Cdc42對小鼠成釉細胞釉基質蛋白表達的影響47-56
• 1. 材料與方法47-51
• 2. 結果51-53
• 3. 討論53-56
• 全文總結56-57
• 參考文獻57-61
• 成果61-62
• 致謝62-64

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 江中明,呂春堂,周中華;成釉細胞的研究進展[J];第二軍醫(yī)大學學報;2004年01期

2 王冠宇;;成釉細胞的培養(yǎng)及其在釉質形成中的作用[J];醫(yī)學綜述;2007年24期

3 陳黎明;馮莉;楊威;田茂能;王穎莉;;高氟對人成釉細胞的凋亡作用及相關基因表達的影響[J];第三軍醫(yī)大學學報;2010年24期

4 張海英;邵丹;李伯翰;韓婷婷;李東亮;王玉敏;孫巖;張娟娟;高玉光;;整合素β1調(diào)控成釉細胞外基質蛋白表達的研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2013年05期

5 馬林;張穎;張凱強;顧何峰;劉璐;程睿波;張思宇;;不同濃度氟化物對體外培養(yǎng)成釉細胞活性的影響[J];口腔醫(yī)學;2013年10期

6 高 潔,田立坤,王兆元,劉冬娟;大鼠成釉細胞的原代培養(yǎng)和光、電鏡觀察[J];口腔醫(yī)學;2002年02期

7 楊威;柴松宏;陳黎明;馮莉;蔣勇;;氟作用下小鼠切牙成釉細胞的結構改變[J];安徽醫(yī)科大學學報;2007年05期

8 冀章章;梅陵宣;;短期高濃度氟對小鼠磨牙成釉細胞形態(tài)及骨形成蛋白-4表達的影響[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2008年06期

9 肖長杰;張麗;閆利勇;李俊福;陳岱楙;李紓;;中間層在成釉細胞分化及分泌期的形態(tài)學觀察[J];泰山醫(yī)學院學報;2011年09期

10 王彩紅;田劍剛;高江紅;阮建平;;染氟成釉細胞差異表達基因的初步篩選[J];西安交通大學學報(醫(yī)學版);2013年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 李紹岳;楊萍;劉建國;季伯;陳舟;顧瑜;張劍;管曉燕;;燃煤型氟斑牙大鼠成釉細胞的顯微和亞顯微結構觀察[A];全國第八次牙體牙髓病學學術會議論文匯編[C];2011年

2 孫宏晨;劉明;歐陽喈;文胡實;李廣生;;過量氟對大鼠切牙成釉細胞增殖與凋亡的影響[A];中華口腔醫(yī)學會第二次全國會員代表大會暨第七次全國口腔醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2001年

3 陶謙;黃洪章;潘朝斌;陳偉良;曾融生;;EGFR、C-erbB-2在成釉細胞中的表達及意義[A];第一屆全國口腔頜面部腫瘤學術會議論文匯編[C];2001年

4 王翔宇;;鈣劑對大鼠氟斑牙發(fā)生的拮抗作用研究[A];全國第八次牙體牙髓病學學術會議論文匯編[C];2011年

5 高春娜;王強;羅平平;;過量氟對大鼠切牙成釉細胞TGF-β3表達的影響[A];2007年第七次全國牙體牙髓病學學術會議論文集[C];2007年

6 朱慶林;李適廷;余擎;孔輝;倪龍興;;Runx2對成釉細胞分化和釉質發(fā)育的作用[A];全國第八次牙體牙髓病學學術會議論文匯編[C];2011年

7 季伯;劉建國;王凱;李紹岳;顧瑜;陳舟;管曉燕;;燃煤型氟斑牙大鼠成釉細胞中Bcl-2及Bax蛋白表達的變化[A];全國第八次牙體牙髓病學學術會議論文匯編[C];2011年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉進忠;成釉細胞瘤細胞增殖與分化的研究[D];武漢大學;2002年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐樂;氟離子對成釉細胞功能活性影響的相關研究[D];山東大學;2016年

2 呂曉琳;Cdc42對小鼠釉質發(fā)育影響的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

3 冀章章;短期高濃度氟對小鼠磨牙成釉細胞形態(tài)及骨形成蛋白-4表達的影響[D];安徽醫(yī)科大學;2009年

4 馮莉;高氟對人牙胚成釉細胞影響的實驗研究[D];遵義醫(yī)學院;2009年

5 楊婷;高氟對成釉細胞生物學特性影響的體外研究[D];第四軍醫(yī)大學;2011年

6 肖長杰;中間層在成釉細胞分化及分泌期的形態(tài)學觀察及礦化相關蛋白的表達研究[D];山東大學;2007年

7 曾憲莉;1，，25-（OH）_2D_3對豬成釉細胞生物學特性的影響[D];鄭州大學;2010年

8 鐘煒軻;氟對小鼠成釉細胞Nrf2信號通路的作用研究[D];廣東藥學院;2012年

9 周密;氟敏感ClC通道的篩選及其機制的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2013年

10 湯曄;硒、鉬、硼對氟中毒大鼠氟代謝及其成釉細胞生物學特性影響的實驗研究[D];遵義醫(yī)學院;2010年

本文編號：957588