本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)hTERT人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： OMECs hTERT 慢病毒載體 穩(wěn)定表達(dá) 永生化

【摘要】：目的:口腔黏膜疾病是發(fā)生于口腔黏膜的所有疾病的總稱,其種類繁多,病因復(fù)雜且多數(shù)疾病的致病機(jī)理尚未完全明確。其中起源于口腔黏膜的惡性腫瘤不僅發(fā)病率高而且成為影響人們生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病,甚至嚴(yán)重威脅著生命健康。由于正常的OMECs體外培養(yǎng)困難,對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求高而且存活時(shí)間短,一般傳代培養(yǎng)5~6代后即開(kāi)始衰老死亡,這嚴(yán)重限制了我們對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入研究,因此,迫切需要一個(gè)能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的OMECs系來(lái)作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。本文研究目�?1.使用慢病毒過(guò)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建pLVX-puro-hTERT重組質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行包裝;2.以包裝成功的慢病毒顆粒感染口腔黏膜上皮細(xì)胞(OMECs),建立穩(wěn)定表達(dá)外源性人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的口腔黏膜上皮細(xì)胞系,為探索建立高效、穩(wěn)定的永生化口腔上皮細(xì)胞系提供新的思路。方法:1.通過(guò)提取293T細(xì)胞總RNA,RT-PCR方法擴(kuò)增獲得hTERT基因全長(zhǎng),構(gòu)建重組慢病毒載體p LVX-puro-hTERT并使用輔助包裝系統(tǒng)將其包裝為慢病毒顆粒;2.通過(guò)使用DisepaeⅡ酶分離,結(jié)合Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),體外分離培養(yǎng)獲取原代OMECs,并用包裝好的慢病毒顆粒感染OMECs,通過(guò)嘌呤霉素抗性篩選得到陽(yáng)性克隆,進(jìn)行傳代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察其生物學(xué)性狀;3.采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)培養(yǎng)7代后感染細(xì)胞中hTERT基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.通過(guò)RT-PCR獲得目的基因片段hTERT,核酸電泳檢測(cè)可見(jiàn)3kb處有一條亮帶,與目的基因大小基本一致。2.重組質(zhì)粒pLVX-puro-hTERT經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切鑒定后,可在3.3kb左右處得到一條亮帶,初步表明hTERT已成功插入慢病毒載體pLVX-puro。3.通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序,進(jìn)一步證實(shí)重組慢病毒載體pLVX-puro-hTERT構(gòu)建成功。4.顯微鏡下觀察可見(jiàn)成功轉(zhuǎn)染hTERT的OMECs與正常OMECs形態(tài)相似,細(xì)胞呈多邊形,“鋪路石”狀緊密排列,具有典型的上皮細(xì)胞特征。而轉(zhuǎn)染空載體后的細(xì)胞形態(tài)較不規(guī)則,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體后的細(xì)胞傳4-5代后生長(zhǎng)緩慢,逐漸衰老死亡,而轉(zhuǎn)染hTERT后的OMECs仍生長(zhǎng)迅速并且增殖穩(wěn)定。5.qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后OMECs中hTERT的相對(duì)表達(dá),結(jié)果顯示:hTERTmRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá),與正常OMECs組中hTERTmRNA的表達(dá)量呈顯著性差異。表明慢病毒介導(dǎo)的hTERT基因片段已穩(wěn)定整合到OMECs的基因組中并高表達(dá)(P0.01)。6.Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中hTERT蛋白成功表達(dá),與正常細(xì)胞組呈顯著差異。這說(shuō)明hTERT基因已成功整合入口腔黏膜上皮細(xì)胞的基因組并可進(jìn)行翻譯。結(jié)論:本研究通過(guò)慢病毒法成功建立了過(guò)表達(dá)hTERT的OMECs穩(wěn)定細(xì)胞系,初步證明了使用慢病毒載體介導(dǎo)hTERT基因永生化OMECs的可能性及優(yōu)越性,為探索構(gòu)建高效、穩(wěn)定增殖的人永生化口腔粘膜上皮細(xì)胞細(xì)胞系提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：OMECs hTERT 慢病毒載體 穩(wěn)定表達(dá) 永生化
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.5
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 縮略詞表9-10
• 第一章 背景研究10-13
• 1.1 口腔黏膜病變的危害10-11
• 1.2 人口腔上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)11
• 1.3 永生化的機(jī)制11
• 1.4 永生化的方法11-12
• 1.5 本文的研究思路12-13
• 第二章 HTERT-PLVX重組慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒包裝13-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器13-15
• 2.1.1 主要試劑和儀器13-14
• 2.1.2 主要溶液及配置14-15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-21
• 2.2.1 p LVX-puro-hTERT慢載體的構(gòu)建15-20
• 2.2.2 hTERT-p LVX慢病毒包裝20-21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 2.3.1 hTERT基因的克隆21
• 2.3.2 hTERT重組質(zhì)粒雙酶切鑒定21-22
• 2.3.3 測(cè)序結(jié)果22-25
• 2.3.4 hTERT-p LVX慢病毒包裝25-26
• 2.4 討論26-27
• 第三章 人口腔上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定27-32
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器27-28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-29
• 3.2.1 口腔粘膜上皮細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)28
• 3.2.2 口腔粘膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)28
• 3.2.3 口腔粘膜上皮細(xì)胞的凍存28-29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 3.3.1 口腔粘膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)結(jié)果29-30
• 3.3.2 口腔粘膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)30
• 3.4 討論30-32
• 第四章 過(guò)表達(dá)HTERT人口腔上皮穩(wěn)細(xì)胞系的篩選及鑒定32-42
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器32-34
• 4.1.1 主要材料和試劑32
• 4.1.2 主要溶液及配置32-34
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法34-39
• 4.2.1 過(guò)表達(dá)hTERT口腔上皮穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選34
• 4.2.2 qRT-PCR檢測(cè)hTERT基因表達(dá)34-37
• 4.2.3 Western Blot檢測(cè)hTERT蛋白表達(dá)37-39
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-41
• 4.3.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)及表型39
• 4.3.2 qRT-PCR檢測(cè)hTERT基因表達(dá)結(jié)果39-41
• 4.4 討論41-42
• 第五章 結(jié)論與展望42-45
• 5.1 結(jié)論42
• 5.2 展望42-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 在學(xué)期間主要研究成果49-50
• 致謝50

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 何義舟;hTERT及其基因表達(dá)與調(diào)控[J];河北醫(yī)學(xué);2003年08期

2 王俊梅,張波,楊邵敏,韓繼生,李冰思,侯琳;PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN TELOME RASE REVERSE TRANSCRIPTASE[J];Chinese Medical Sciences Journal;2003年03期

3 應(yīng)磊,戴冰冰,王楚,盧健,錢(qián)關(guān)祥;EFFECTS OF SP1 SITE TO hTERT PROMOTER ACTIVITY AND ITS RESPONSE TO RETINOID ACID[J];Journal of Shanghai Second Medical University;2005年01期

4 陳鳳花;胡麗華;李一榮;王琳;;Expression of Telomerase Subunits in Gastric Cancer[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年06期

5 李慎秋;熊芬;張春梅;;hTERT在原發(fā)性皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年02期

6 Kawin Leelawat;Surang Leelawat;Thawee Ratanachu-Ek;Somboon Trubwongchareon;Jerasak Wannaprasert;Saad Tripongkaruna;Suchart Chantawibul;Panadda Tepaksorn;;Circulating hTERT mRNA as a tumor marker in cholangiocarcinoma patients[J];World Journal of Gastroenterology;2006年26期

7 丁麗;;人B7.2/hTERT融合基因真核綠色熒光載體的構(gòu)建[J];鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年02期

8 滕勇;胡蘊(yùn)玉;王捍國(guó);宿學(xué)家;王臻;關(guān)玉成;高杰;;hTERT激活人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞端粒酶活性[J];中國(guó)矯形外科雜志;2007年16期

9 張險(xiǎn)峰;江應(yīng)安;羅和生;陳維進(jìn);;hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J];國(guó)際消化病雜志;2008年05期

10 李一冬;趙國(guó)新;曹明瑞;;hTERT重組綠色熒光表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 Shuying Gao;;Construction and identification of a recombinant lentiviral expression vector containing hTERT gene[A];第五屆全國(guó)生物信息學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2012年

2 李瑋;譚建;吳蓓;李寧;;特異性hTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中的啟動(dòng)效率研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第30次學(xué)術(shù)年會(huì)暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

3 于潔;高書(shū)穎;;攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體的構(gòu)建[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

4 ;Simultaneous inhibition of both hTERT and AR gene expression in LNCaP cells using single shRNA vector[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

5 趙同偉;盧麗琴;;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展[A];浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腫瘤專業(yè)委員會(huì)第六次學(xué)術(shù)年會(huì)暨省級(jí)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2005年

6 黃健;楊敏;金潔;;尿多酸肽對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞端粒酶活性及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)表達(dá)的影響及機(jī)制研究[A];2012年浙江省血液病學(xué)年會(huì)論文集[C];2012年

7 李保順;陳瓊;胡成平;李曉婕;劉勝崗;梁碩;;hTERT siRNA抑制肺癌A549細(xì)胞端粒酶活性及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)呼吸病學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

8 ;Tumor therapeutic effect of hTERT targeted lentivirus,monitored by whole-body noninvasive imaging[A];第九次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議專題報(bào)告論文集[C];2009年

9 張鵬輝;姜習(xí)新;涂植光;;hTERT/U6嵌合啟動(dòng)子對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向作用分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

10 ;The Effects of Tankyrase1、hTERT Transfection on Corpus Cavernosum Smooth Muscle Cell[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)男科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 張中橋;檢測(cè)hTERT表達(dá)預(yù)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

2 王振嶺;反義hTERT可促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

3 王振嶺;反義hTERT可促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549凋亡[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

4 吳一福;宮頸癌基因治療特異性新技術(shù)研究成功[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 胡長(zhǎng)江;FOXO3a/FOXM1在hTERT介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲、化療敏感性中的作用及分子機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 宋鴿;GRSF1介導(dǎo)miR-346上調(diào)hTERT表達(dá)的作用與機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

3 郭紅;抗消化系惡性腫瘤hTERT廣譜疫苗的分子設(shè)計(jì)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 肖毅;以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤治療性腺病毒疫苗的研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

5 盛建飛;hTERT非端粒酶依賴途徑調(diào)控喉鱗癌細(xì)胞凋亡的研究[D];武漢大學(xué);2012年

6 余松濤;hTERT啟動(dòng)子靶向性活體光學(xué)實(shí)時(shí)成像技術(shù)在腫瘤診斷及療效評(píng)估中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

7 陳陵;hTERT調(diào)控相關(guān)miRNA的鑒定及功能研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

8 夏云;靶向人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）RNA干擾的建立及其生物學(xué)效應(yīng)的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

9 王建;靶向hTERT的RNA干擾及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡影響的機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

10 欒芳;乙肝病毒調(diào)控hTERT及ZHX2在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 鄔賢;重組腺病毒介導(dǎo)的hTERT C197片段抗腫瘤活性及分子機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李三黨;siRNA沉默β-catenin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞hTERT影響的研究[D];蘭州大學(xué);2015年

3 曹汀明;不同還原態(tài)葉酸對(duì)人A375及BJ細(xì)胞株hTERT和hMLH1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響[D];云南師范大學(xué);2015年

4 曾令花;DDRGK1與端粒酶催化亞基hTERT相互作用的研究[D];杭州師范大學(xué);2015年

5 李陽(yáng);hTERT調(diào)控Gli1的表達(dá)對(duì)胃癌侵襲遷移的影響及其分子機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 侯雙雙;膽管癌患者膽汁脫落細(xì)胞中hTERT、PinX1mRNA的檢測(cè)及其意義[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2016年

7 曾颯;慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)hTERT人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建[D];蘭州大學(xué);2016年

8 梁光萍;hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胚胎成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

9 丁麗;表達(dá)B7.2/hTERT載體的構(gòu)建和表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2006年

10 苗佩宏;hTERT蛋白表達(dá)及其模擬表位篩選[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

，

本文編號(hào)：871304