本文關鍵詞：基于細胞膜片技術構建無支架組織工程血管化骨的實驗研究

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【摘要】：目的：探討完全利用原代大鼠骨髓間充質干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells BMSCs)體外構建無支架組織工程血管化骨,并用于修復大鼠顱骨臨界骨缺損的可行性。方法：(1)BMSCs的體外培養(yǎng)與生長特性的觀察：全骨髓貼壁法分離,培養(yǎng),純化BMSCs,利用倒置顯微鏡觀察其生長特性并拍照。(2)BMSCs向內皮細胞誘導分化：將第2代純化的BMSCs采用內皮細胞誘導培養(yǎng)液誘導14天,倒置顯微鏡觀察其生長特性,并通過流式細胞儀鑒定誘導形成的內皮細胞(Endothelial cells ECs)。(3)預血管化膜片的構建：將第2代純化的BMSCs以9×104/cm2的密度接種于六孔板,并在體外連續(xù)培養(yǎng)2周形成未分化膜片,將誘導形成的ECs細胞以5×104/cm2的密度均勻接種于未分化膜片,在內皮細胞誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天,倒置相差顯微鏡下觀察內皮細胞在未分化膜片上的分布情況。(4)三維血管化無支架組織工程骨的構建：通過細胞刮刀刮取預血管化膜片,利用鑷子將完整的預血管化膜片提起并平鋪到成骨細胞膜片表面,通過成骨細胞膜片卷曲包裹預血管化膜片,形成三維血管化復合膜片,作為實驗組；將未分化膜片平鋪到成骨細胞膜片表面,通過成骨細胞膜片卷曲包裹未分化膜片,形成三維復合膜片,作為對照組。(5)實驗組和對照組膜片用于修復大鼠顱骨缺損：利用牙科鉆制取直徑8mmm的大鼠顱骨全層圓形缺損,并將實驗組和對照組復合膜片植入顱骨缺損處。并于術后2周、4周、8周通過大體觀察、HE染色、CD-31染色、X線檢測、Van Gieson染色及Trap染色檢測植入膜片的成血管和成骨能力。結果：(1)我們成功地培養(yǎng)出了大鼠BMSCs,該細胞呈長梭形,多克隆樣生長(2)純化的BMSCs(?)在內皮細胞誘導液中向ECs誘導分化,鏡下可見誘導形成的ECs呈典型的“鋪路石”樣生長方式生長,流式細胞檢測顯示大約有38%的細胞表達CD-31陽性。(3)進一步將誘導形成的ECs均勻的接種至未分化膜片上,3天后,倒置相差顯微鏡以及CD-31免疫熒光染色顯示在其表面有空泡樣結構的形成。(4)術后2周,HE染色和CD-31免疫組化染色顯示,實驗組新生的血管較對照組顯著增多,術后4周和8周,通過HE和van-Gieson染色顯示,實驗組新骨形成量明顯較對照組多,并且實驗組和對照組的破骨細胞染色結果均呈陽性。結論：(1)本實驗證明通過全骨髓貼壁法能夠獲取較純的大鼠BMSCs,較之于其他實驗方法,該方法更方便,且費用較低。(2)通過培養(yǎng)基中加入血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor b-FGF)能夠誘導BMSCs向內皮細胞樣細胞分化,并且,誘導形成的ECs不管在形態(tài)和特征上都與內皮細胞相似。(3)在未分化膜片上接種BMSCs誘導形成的ECs,體外能夠構建出預血管化膜片。(4)體外構建的復合膜片植入大鼠顱骨缺損區(qū)能形成大量與宿主血管吻合良好的毛細血管,同時有新生骨組織的形成,較之于無血管化三維復合膜片,有效修復了大鼠顱骨臨界骨缺損。本實驗為無支架組織工程骨的構建提供了一個新的策略。
【關鍵詞】：骨髓間充質干細胞 組織工程骨 細胞膜片預血管化
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R782.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 附錄7-10
• 前言10-12
• 文獻回顧12-17
• 一 BMSCs向ECs誘導的研究現狀12-13
• 二 細胞膜片技術的機制原理13
• 三 利用細胞膜片技術構建組織工程骨的研究現狀13-15
• 四 細胞膜片作為仿生骨膜,促進骨缺損的修復15
• 五 細胞膜片在組織工程血管化領域的研究現狀15-17
• 實驗一 大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)的體外培養(yǎng)與干細胞膜片的構建17-25
• 1. 實驗材料17-18
• 2 實驗方法18-20
• 3 實驗結果20-22
• 4 實驗討論22-25
• 實驗二 大鼠骨髓間充質干細胞預血管化膜片構建25-31
• 1 實驗材料25-26
• 2 實驗方法26-27
• 3 實驗結果27-29
• 4 實驗討論29-31
• 實驗三 基于細胞膜片構建無支架組織工程血管化骨修復大鼠顱骨臨界極限缺損31-41
• 1 實驗材料31-32
• 2 實驗方法32-34
• 3 實驗結果34-39
• 4 討論39-40
• 5 結論40-41
• 參考文獻41-46
• 病例匯報46-52
• 研究生期間的研究成果52-53
• 致謝53

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