本文關鍵詞：腺病毒介導的鈣粘蛋白11基因轉染大鼠牙髓細胞的實驗研究

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【摘要】：目的：1.分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠牙髓細胞,并建立高效穩(wěn)定的大鼠牙髓細胞培養(yǎng)方法。2.構建cadherin11腺病毒載體(Ad-Cadherin11),并以此轉染大鼠牙髓細胞(rat dental pulp cells),檢測cadherin11的表達,探討腺病毒介導的鈣粘蛋白11 (Ad-Cadherin11)轉染對體外培養(yǎng)的大鼠牙髓細胞生長的影響,為進一步研究cadherinll基因的功能奠定基礎。方法：1.大鼠牙髓細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：脫頸處死2月齡wistar大鼠,在無菌條件下劈開牙冠取大鼠的牙髓組織,并且切除根尖處約1mm左右的牙髓組織,將剩余牙髓組織剪成約1mm3左右,放入培養(yǎng)瓶并以1cm的間距均勻鋪于瓶底,加入含200ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞融合約為80～90%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代細胞,觀察細胞形態(tài)、大小、貼壁及生長情況。取第3代大鼠牙髓細胞,收集細胞樣品,石蠟包埋,并進行波形絲蛋白、角蛋白免疫細胞化學染色,光鏡下觀察。2.Ad-cadherin11轉染大鼠牙髓細胞的實驗研究：cadherin11載體構建、293細胞擴增復制重組腺病毒,測定病毒滴度。體外分離培養(yǎng)大鼠牙髓細胞,轉染病毒,熒光顯微鏡下觀察轉染效果,并以細胞計數(shù)法檢測病毒轉染效率。對轉染cadherin11目的基因后的大鼠牙髓細胞進行形態(tài)學觀察,細胞計數(shù)法分析轉染后大鼠牙髓細胞的體外增殖情況,繪制生長曲線,并用免疫細胞化學及半定量逆轉錄聚合酶鏈(RT-PCR)檢測目的基因cadherin11的表達。結果：1.大鼠牙髓細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定： (1)原代大鼠牙髓細胞呈圓形折光性強的細胞,貼壁后多數(shù)呈長梭形、成纖維狀,細胞逐漸增殖,呈集落狀生長,細胞排列緊密,周邊呈短梭形,體積較小,10d左右可單層融合。(2)傳代獲得的大鼠牙髓細胞大小勻稱,均勻鋪于培養(yǎng)瓶,為成纖維細胞狀,呈極性生長,在體外具有很強的增殖能力,5 d左右即可單層融合。(3)從生長曲線得出,開始兩天細胞生長較平緩,增殖慢,三天后細胞迅速增殖,一周后則呈平穩(wěn)狀態(tài),細胞數(shù)變化較小甚至逐漸減少,P10代后細胞逐漸老化,群體的倍增時間大約為6.71 h。(4)波形絲蛋白染色呈陽性反應,而角蛋白染色則呈陰性反應,這些均說明所培養(yǎng)得細胞是來源于中胚層的牙髓細胞。2.Cadherin11轉染大鼠牙髓細胞的實驗： (1)成功構建了Cadherin11腺病毒表達載體,測得病毒滴度均為：1X1010TU/ml。 (2) Cadherin11基因成功轉染大鼠牙髓細胞,在感染復數(shù)(MOI)為50時轉染大鼠牙髓細胞效率達到最高,病毒轉染牙髓細胞48h后,可看到超過70%的大鼠牙髓細胞出現(xiàn)熒光表達。 (3)從生長曲線得出,實驗組(Ad-cadherin11)與對照組(Ad-EGFP)及空白對照組相比,發(fā)現(xiàn)cadherin11目的基因對牙髓細胞生長有明顯促進作用。(4)免疫細胞化學及RT-PCR均檢測出攜目的基因實驗組細胞均顯示陽性反應及高表達。結論：1.從大鼠牙髓組織中分離、培養(yǎng)獲得的大鼠牙髓細胞,其在體外環(huán)境中仍具有較強的增殖能力,并且細胞可長期傳代而不會影響其穩(wěn)定生長,為cadherin11轉染大鼠牙髓細胞的實驗奠定了基礎。2.成功構建了Cadherin11腺病毒表達載體,AD-cadherin11轉染大鼠牙髓細胞后,對細胞生長有明顯的促進作用。
【關鍵詞】：牙髓細胞 腺病毒載體 基因轉染 生長曲線 免疫細胞化學 RT-PCR
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R780.2
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 實驗一 大鼠牙髓細胞的分離培養(yǎng)與鑒定14-30
• 材料與方法14-18
• 結果18-21
• 討論21-25
• 結論25-26
• 參考文獻26-30
• 實驗二 Cadherin11腺病毒表達載體的構建及其轉染大鼠牙髓細胞后細胞增殖的研究30-49
• 材料與方法30-36
• 結果36-42
• 討論42-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-49
• 綜述49-70
• 參考文獻60-70
• 致謝70-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文71

【參考文獻】

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本文編號：845030