本文關(guān)鍵詞：靜態(tài)牽張力作用下健康和牙周病微環(huán)境來源PDLSCs生物學功能及LncRNA表達譜的研究

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【摘要】：正畸治療可以通過移動牙齒改善患者的外貌和笑容,在我國越來越多的成人患者開始尋求完善的正畸治療,但牙周病高發(fā)病率是成人正畸中無法忽視的問題。牙周病發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)是慢性炎癥導致的牙周組織喪失、牙齒松動脫落,目前對牙周病的治療主要包括炎癥控制和牙周組織再生等方法。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)因其高增殖分化能力和組織同源性被看作牙周再生中最重要的種子細胞之一。正畸牙齒移動時,PDLSCs可以對力學刺激產(chǎn)生應(yīng)答,在牙周組織改建中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。研究表明,牙周炎微環(huán)境下PDLSCs的再生能力會受到損害,但其對力的反應(yīng)是否出現(xiàn)異常尚未可知。Lnc RNA已被證實在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用,同時已有研究顯示健康牙周組織和牙周病牙周組織中存在大量差異表達的Lnc RNA,但Lnc RNA是否調(diào)控健康牙周組織來源的PDLSCs(PDLSCs obtained from healthy periodontal tissues,HPDLSCs)和牙周病組織來源的PDLSCs(PDLSCs obtained from periodontal tissues of periodontitis patients,PPDLSCs)對靜態(tài)牽張力(Static mechanical strain,SMS)的反應(yīng)還有待研究。因此針對上述問題,本課題進行了兩部分研究:第一部分HPDLSCs和PPDLSCs對不同級別SMS的反應(yīng)及最佳力值篩選研究目的1.分離培養(yǎng)HPDLSCs和PPDLSCs并鑒定其生物學特性2.明確不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs增殖及成骨能力的影響3.明確不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs破骨能力及炎癥反應(yīng)的影響4.尋找促進HPDLSCs和PPDLSCs再生能力的最佳SMS力值研究方法1.采用低密度接種法分離培養(yǎng)HPDLSCs和PPDLSCs,流式細胞儀檢測細胞表面間充質(zhì)干細胞標記物的表達,克隆形成能力檢測細胞增殖活性,茜素紅染色檢測細胞成骨能力;2.使用Flexcell Tension Unit對HPDLSCs和PPDLSCs進行6%、8%、10%、12%、14%的SMS加載;3.在不同級別SMS加載后,使用流式細胞儀檢測HPDLSCs和PPDLSCs的細胞周期,MTT檢測HPDLSCs和PPDLSCs的細胞活性,ALP染色、ALP活性檢測、茜素紅染色、實時定量RT-PCR檢測HPDLSCs和PPDLSCs的成骨能力;4.在不同級別SMS加載后,實時定量RT-PCR檢測HPDLSCs和PPDLSCs中破骨基因Rankl和C-fos的表達,Elisa檢測HPDLSCs和PPDLSCs中炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌情況。實驗結(jié)果1.HPDLSCs和PPDLSCs均強陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標記物Stro-1、CD146、CD90和CD29,陰性表達造血系標記物CD31和CD14,同時,Stro-1、CD146、CD90和CD29在HPDLSCs中的表達比率均顯著高于在PPDLSCs�？寺⌒纬赡芰z測顯示HPDLSCs的克隆形成率為37%,PPDLSCs的克隆形成率為64%。茜素紅染色結(jié)果證實HPDLSCs和PPDLSCs均可以形成礦化結(jié)節(jié),其中HPDLSCs形成的礦化結(jié)節(jié)較PPDLSCs多且面積大。2.細胞周期和MTT實驗結(jié)果顯示,在未加力情況下,PPDLSCs的增殖能力明顯高于HPDLSCs;而在牽張力加載后,從6%到14%的SMS對HPDLSCs的增殖能力均產(chǎn)生了促進作用,其中12%的力值促進作用最佳;對于PPDLSCs,只有6%和8%的SMS能夠促進其增殖,其中8%的力值效果更優(yōu);當SMS大于8%時,PPDLSCs的增殖能力隨力值增加而顯著下降。ALP染色、ALP活性檢測、茜素紅染色和實時定量RT-PCR結(jié)果一致顯示,在未加力情況下,PPDLSCs的成骨能力低于HPDLSCs,而在SMS加載后,HPDLSCs中各項成骨指標均顯著上調(diào),其中12%SMS對HPDLSCs的成骨作用促進能力最強;而對于PPDLSCs,8%SMS能最大程度促進其成骨能力,當力值大于8%時,會對PPDLSCs的成骨能力產(chǎn)生明顯的抑制作用。3.實時定量RT-PCR檢測加力組和對照組HPDLSCs及PPDLSCs中Rankl、C-fos的表達,結(jié)果顯示,在未加力情況下,PPDLSCs中Rankl和C-fos的表達水平明顯高于HPDLSCs;而在牽張力加載后,當力值低于12%時,HPDLSCs中Rankl和C-fos的表達水平較未加力時無明顯變化;當力值大于12%時,Rankl和C-fos的表達顯著上調(diào);在PPDLSCs組,當力值低于8%時,Rankl和C-fos的表達無明顯變化,當力值大于8%時,可明顯激活兩種破骨基因的表達。Elisa檢測結(jié)果顯示,PPDLSCs中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表達水平均高于HPDLSCs;在SMS加載后,HPDLSCs和PPDLSCs中IL-1β和TNF-α的表達水平略有升高,但不同力值對炎癥因子的表達無明顯差異,而在SMS加載后IL-6和IL-8的表達水平發(fā)生了大幅上調(diào);在HPDLSCs組,當力值低于12%時,加力組各組間IL-6和IL-8的表達水平無明顯差異,但當力值高于12%時,IL-6和IL-8的表達水平顯著上升;而在PPDLSCs組,6%和8%的牽張力值對IL-6和IL-8的表達影響基本無區(qū)別,但當力值大于8%,IL-6和IL-8的表達會隨著力值的增大而逐漸增強。結(jié)論1.HPDLSCs和PPDLSCs均表達間充質(zhì)干細胞標記物,具有自我更新和多向分化潛能;但牙周病微環(huán)境刺激了PPDLSCs的增殖能力、損害了其間充質(zhì)干細胞表達率和成骨能力;2.HPDLSCs和PPDLSCs對SMS的反應(yīng)不同,炎癥微環(huán)境使得PPDLSCs的力學敏感性增強,耐受性減弱;過大的靜態(tài)牽張力會導致PPDLSCs的增殖能力降低,成骨破骨平衡被破壞,炎癥反應(yīng)被激活;3.從促進牙周再生和組織改建的角度,施加于HPDLSCs的最佳SMS力值為12%,PPDLSCs的最佳SMS為8%。第二部分12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中Lnc RNA芯片表達譜研究研究目的1.篩選12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中差異表達的Lnc RNA2.對HPDLSCs和PPDLSCs中Lnc RNA的差異表達情況及功能進行分析研究方法1.12%SMS加載后,TRIzol提取HPDLSCs和PPDLSCs總RNA,RNasey Mini Kit對RNA進行純化,分光光度計檢測對樣本RNA進行質(zhì)檢及濃度測定,瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本完整性以及是否被g DNA污染,合成并純化c DNA后Nano Drop ND-1000檢測其質(zhì)量,Nimble Gen Hybridization系統(tǒng)和Nimble Gen wash buffer進行芯片雜交洗滌,Axon Gene Pix 4000B進行芯片掃描,Nimble Scan software和Agilent Gene Spring GX software進行圖像數(shù)據(jù)分析。2.利用KEGG生物學通路分析、GO分析、CNC分析對差異表達的Lnc RNA進行功能分析3.實時定量PCR驗證Lnc RNA芯片的可信度實驗結(jié)果1.分光光度計檢測結(jié)果顯示,HPDLSCs和PPDLSCs樣本中提取的RNA吸光度值均在1.8-2.1之間,接近2.0。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示各樣本所提取RNA無g DNA污染,無明顯降解,可以用于后續(xù)芯片實驗。箱圖結(jié)果可見6個細胞樣本芯片熒光信號的強度一致,因此不會因信號不一致而導致結(jié)果不可靠。散點圖、火山圖、聚類圖直觀的顯示出HPDLSCs和PPDLSCs在牽張力加載后存在大量差異表達的Lnc RNA。2.在12%SMS加載后變化倍數(shù)2且有統(tǒng)計學意義的Lnc RNA在HPDLSCs中有8847種,PPDLSCs中有9772種,在HPDLSCs和PPDLSCs中共同表達的Lnc RNA有7223種;而僅在HPDLSCs加力后發(fā)生變化的為1624種,其中表達倍數(shù)20倍的為27種(均為上調(diào));僅在PPDLSCs加力后表達發(fā)生變化的為2549種,其中表達倍數(shù)20倍的為16種(9種上調(diào),7種下調(diào))。3.KEGG生物學通路分析顯示在HPDLSCs中差異表達的生物學通路包括脂肪酸降解通路、MAPK信號通路、血管平滑肌收縮通路、脂肪酸代謝通路、淀粉和蔗糖代謝通路、葉酸碳庫通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、礦化吸收通路、鈣離子信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路;而在PPDLSCs中差異表達的生物學通路包括鞘脂類代謝通路、可卡因成癮通路、Erb B信號通路、亨廷頓氏舞蹈病通路、賴氨酸生物合成通路、B細胞受體信號通路、膀胱癌通路、同源重組通路、非小細胞肺癌通路、非酒精脂肪肝疾病通路。GO分析結(jié)果顯示在HPDLSCs中差異表達的BP(biological process)條目有多個與力學刺激和細胞外信號轉(zhuǎn)導相關(guān),例如response to stress、regulation of response to stimulus等;而在PPDLSCs中這些通路條目沒有出現(xiàn)。CNC分析結(jié)果顯示,差異表達最為顯著的10個Lnc RNA能夠與相應(yīng)m RNA形成1250個共表達基因?qū)?對這些共表達的m RNA進行KEGG分析結(jié)果顯示其主要與arginine and proline mtabolism、cell adhesion molecules和leukocyte transendothelial migration通路有關(guān)。4.實時定量RT-PCR顯示,隨機選取的四種Lnc RNA(TCONS_00008604、ENST00000428781、Uc004arq.1、ENST00000445814)表達情況與芯片結(jié)果趨勢一致。結(jié)論1.本實驗收集的RNA樣本質(zhì)檢合格,可用于Lnc RNA芯片實驗;2.12%SMS加載條件下HPDLSCs和PPDLSCs中存在大量差異表達的Lnc RNA;3.HPDLSCs中差異表達m RNA涉及的生物學通路大都為正常生物學反應(yīng)通路,而PPDLSCs中差異表達m RNA涉及的生物學通路多數(shù)與疾病相關(guān);4.在HPDLSCs中差異表達顯著的與力學刺激和細胞外信號傳導相關(guān)通路在PPDLSCs中未發(fā)生明顯變化,說明牙周炎微環(huán)境可能導致PPDLSCs對力學刺激的反應(yīng)出現(xiàn)異常;5.實時定量RT-PCR結(jié)果顯示四種隨機選取Lnc RNA的變化趨勢同芯片結(jié)果一致,其中ENST00000445814差異表達倍數(shù)達250倍,可能作為我們下一步的研究目標。
【關(guān)鍵詞】：牙周病微環(huán)境 正畸 牽張力 牙周膜干細胞 長鏈非編碼RNA
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-20
• 前言20-22
• 文獻回顧22-33
• 第一部分 HPDLSCS和PPDLSCS對不同級別SMS的反應(yīng)及最佳力值篩選33-60
• 實驗一 HPDLSCS和PPDLSCS的培養(yǎng)、鑒定及SMS加載裝置的建立35-45
• 1 材料35-36
• 1.1 主要儀器35
• 1.2 主要試劑35-36
• 2 方法36-39
• 2.1 HPDLSCs和PPDLSCs的細胞來源36
• 2.2 HPDLSCs和PPDLSCs的細胞原代培養(yǎng)及純化36-37
• 2.3 HPDLSCs和PPDLSCs的生物學特性鑒定37-38
• 2.4 SMS加載裝置的構(gòu)建38
• 2.5 統(tǒng)計學分析38-39
• 3 結(jié)果39-43
• 3.1 HPDLSCs及PPDLSCs形態(tài)學觀察39
• 3.2 HPDLSCs及PPDLSCs表面分子表型鑒定39-40
• 3.3 HPDLSCs及PPDLSCs克隆形成能力鑒定40-41
• 3.4 HPDLSCs及PPDLSCs多向分化能力鑒定41-43
• 3.5 SMS加載裝置的構(gòu)建43
• 4 討論43-45
• 實驗二 不同級別SMS對HPDLSCS和PPDLSCS增殖及成骨能力的影響45-55
• 1 材料45-46
• 1.1 主要儀器45
• 1.2 主要試劑45-46
• 2 方法46-48
• 2.1 HPDLSCs及PPDLSCs的增殖能力檢測46
• 2.2 HPDLSCs及PPDLSCs的成骨能力檢測46-48
• 2.3 統(tǒng)計學分析48
• 3 結(jié)果48-53
• 3.1 不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs增殖能力的影響48-50
• 3.2 不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs成骨能力的影響50-53
• 4 討論53-55
• 實驗三 不同級別SMS對HPDLSCS和PPDLSCS破骨能力及炎癥反應(yīng)的影響55-60
• 1 材料55
• 1.1 主要試劑55
• 1.2 主要儀器55
• 2 方法55-57
• 2.1 實時定量RT-PCR檢測破骨相關(guān)基因表達55-56
• 2.2 Elisa檢測炎癥因子的分泌水平56
• 2.4 統(tǒng)計學分析56-57
• 3 結(jié)果57-59
• 3.1 不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs破骨基因表達的影響57
• 3.2 不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs炎癥因子分泌的影響57-59
• 4 討論59-60
• 第二部分 12%SMS作用下HPDLSCS和PPDLSCS中LNCRNA芯片表達譜研究5560-93
• 實驗一 HPDLSCS和PPDLSCS芯片樣品的制備、質(zhì)控檢測及基因芯片表達譜構(gòu)建62-71
• 1 材料62-63
• 1.1 主要儀器62
• 1.2 主要試劑62-63
• 2 方法63-65
• 2.1 HPDLSCs及PPDLSCs的細胞培養(yǎng)及SMS加載63
• 2.2 HPDLSCs及PPDLSCs的總RNA提取63
• 2.3 HPDLSCs及PPDLSCs的RNA純化63-64
• 2.4 HPDLSCs及PPDLSCs的RNA質(zhì)檢和濃度測定64
• 2.5 HPDLSCs及PPDLSCs總RNA變性瓊脂糖凝膠電泳檢測64
• 2.6 HPDLSCs及PPDLSCs的cDNA合成64
• 2.7 cDNA的純化、質(zhì)檢及標記64-65
• 2.8 芯片雜交洗滌及掃描65
• 2.9 數(shù)據(jù)分析65
• 3 結(jié)果65-69
• 3.1 HPDLSCs和PPDLSCs樣本RNA的分光光度計檢測結(jié)果65-66
• 3.2 HPDLSCs和PPDLSCs樣本RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果66
• 3.3 HPDLSCs和PPDLSCs樣本RNA的箱圖結(jié)果66-67
• 3.4 HPDLSCs和PPDLSCs樣本RNA的散點圖結(jié)果67
• 3.5 HPDLSCs和PPDLSCs樣本RNA的火山圖結(jié)果67-68
• 3.6 HPDLSCs和PPDLSCs樣本RNA的聚類分析及熱圖結(jié)果68-69
• 4 討論69-71
• 實驗二 HPDLSCS和PPDLSCS中LNCRNA的差異表達情況、功能分析及PCR驗證71-93
• 1 材料71
• 2 方法71-72
• 2.1 數(shù)據(jù)分析71
• 2.2 KEGG（the database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)）生物學通路分析71
• 2.3 GO（the Gene Ontology project）分析71
• 2.4 CNC網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖構(gòu)建及相關(guān)基因的功能注釋71-72
• 2.5 實時定量RT-PCR72
• 2.6 統(tǒng)計學分析72
• 3 結(jié)果72-91
• 3.1 12%SMS加載后HPDLSCs和PPDLSCs中差異表達的LncRNA72-75
• 3.2 12%SMS加載后HPDLSCs和PPDLSCs中差異表達的mRNA75-78
• 3.3 異常表達mRNA的生物信息學預(yù)測研究78-90
• 3.4 實時定量RT-PCR驗證90-91
• 4 討論91-93
• 小結(jié)93-94
• 參考文獻94-104
• 個人簡歷和研究成果104-106
• 致謝106

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本文編號：814939