本文關鍵詞：miR-345-3p在周期性牽張力誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中的生物學功能

  更多相關文章： miR-345-3p 成骨分化 周期性牽張力 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymalstem cells BMSCs)

【摘要】：背景機械力誘導的牙槽骨改建是正畸牙移動最重要的生物學基礎理論之一。機械力激活細胞進行骨改建的機制不僅是正畸領域的研究重點,也是口腔頜面外科、骨科等領域?qū)W者們關注的焦點。體內(nèi)和體外實驗以及臨床應用都發(fā)現(xiàn)在正畸牙齒移動、牽張成骨、骨折修復等過程中,適當?shù)臓繌埩δ艽碳す墙M織的生長與改建。在此過程中,骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)受到張應力的作用,向牽張區(qū)趨化、增殖、成骨分化,是新骨形成的細胞學基礎,是維持骨骼系統(tǒng)穩(wěn)定的關鍵環(huán)節(jié)。微小RNA(MicroRNA, miRNA);是一類由20-24個核苷酸構(gòu)成的負性調(diào)控基因表達的非編碼單鏈RNA分子,普遍存在于各類生物體內(nèi)。通過microRNA來抑制mRNA翻譯已被發(fā)現(xiàn)是一個重要的調(diào)節(jié)骨形成的信號通路。已有大量研究表明,miRNA與BMSCs的成骨分化有密切的關系。然而以往對于牽張力作用下參與BMSCs成骨分化的miRNA少有系統(tǒng)而深入的研究。本課題組在前期實驗中通過高通量基因芯片檢測技術(shù)檢測了周期性牽張力刺激12小時與未受機械力刺激的大鼠BMSCs的miRNA基因表達譜,篩選出了一系列牽張力刺激前后差異表達的miRNA并對這些miRNA進行了驗證。本實驗從中選取表達量顯著降低的miR-345-3p來進行研究,驗證其在周期性牽張力誘導的大鼠BMSCs成骨分化中所發(fā)揮的生物學作用,并利用生物信息學方法對miR-345-3p作用的靶基因進行預測。目的探討并驗證miR-345-3p在周期性牽張力誘導大鼠BMSCs成骨分化過程中的生物學作用,并通過生物信息學研究方法來預測其可能的靶基因。從microRNA的角度初步探索牽張力誘導BMSCs成骨分化的機制,為正畸骨改建及牽張成骨技術(shù)提供理論依據(jù)以及為尋求牽張力條件下口腔診治的新策略提供理論和實驗依據(jù)。方法1.大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,倒置顯微鏡下觀察其生物學形態(tài),CCK-8法檢測其增殖能力；并對其進行成骨、成脂誘導,應用茜素紅染色、ALP染色、油紅O染色法證實其可以分化為成骨細胞及成脂肪細胞；流式細胞術(shù)鑒定細胞表面抗原。2.觀察周期性牽張力作用下大鼠BMSCs內(nèi)ALP活性、成骨相關基因及miR-345-3p隨時間的表達情況：按加載時間將大鼠BMSCs分為4組一--Oh、3h、6h、12h,對各組施以牽張力刺激(1Hz、10%拉伸強度)。通過ALP活性檢測及RT-PCR檢測周期性牽張力作用下大鼠BMSCs ALP活性及Runx2、Osterix、miR-345-3p隨時間變化的表達情況。3.觀察miR-345-3p在周期性牽張力誘導大鼠BMSCs成骨分化中的作用：采用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達和抑制miR-345-3p在大鼠BMSCs中的表達水平,加載周期性牽張力(1Hz、10%拉伸強度)3h,通過RT-PCR、Western blot檢測大鼠BMSCs成骨分化相關標志物的表達水平,研究miR-345-3p在周期性牽張力誘導大鼠BMSCs成骨分化中的生物學功能。4.通過靶基因預測軟件和生物信息學網(wǎng)站篩選miR-345-3p的候選靶基因。結(jié)果1.經(jīng)全骨髓貼壁法所獲得的細胞符合BMSCs的特征,流式細胞儀檢測其表面抗原分子CD44、CD90為陽性,CD34、CD45為陰性,經(jīng)體外誘導可分化為成骨細胞及成脂肪細胞。2.大鼠BMSCs加載周期性牽張力(1Hz,10%拉伸強度)0、3、6、12小時后,隨加力時間延長,ALP活性逐漸增強且受力后即明顯升高(P0.05): Runx2 mRNA、Osterix mRNA表達逐漸升高且分別于受力3小時和6小時后升高明顯(P0.05); miR-345-3p的表達逐漸降低,于3小時達低谷(P0.01),之后逐漸升高,但仍低于對照組表達水平。3.上調(diào)miR-345-3p的表達水平可顯著降低周期性牽張力誘導的大鼠BMSCs的成骨分化能力,RT-PCR結(jié)果表明miR-345-3p mimic組較其對照組ALP、Runx2、 Osterix表達均減少(P0.05); Western blot結(jié)果顯示miR-345-3p mimic組較其對照組ALP及Runx2表達明顯減少。下調(diào)miR-345-3p的表達可增加大鼠BMSCs的成骨能力,RT-PCR結(jié)果表明miR-345-3p inhibitor組較其對照組ALP、Runx2、 Osterix表達均增強(P0.05); Western blot結(jié)果表明inhibitor組較其對照組ALP及Runx2表達明顯增加。4.生物信息學預測Hoxa2、IGF2、CBFB、BCL2、AXIN2、FN1等為miR-345-3p的候選靶基因。結(jié)論1.采用全骨髓貼壁法可分離得到較純的大鼠BMSCs,并且在體外經(jīng)過誘導可分化為成骨細胞及成脂肪細胞。2.周期性牽張力刺激(1Hz,10%拉伸強度)可誘導大鼠BMSCs體外成骨分化；miR-345-3p對牽張力刺激敏感,在細胞水平上證明miR-345-3p參與了周期性牽張力誘導的大鼠BMSCs成骨分化。3.miR-345-3p在周期性牽張力誘導的大鼠BMSCs成骨分化中發(fā)揮負向調(diào)控作用。4.本研究有利于更全面地理解正畸骨改建及牽張成骨的機制,為臨床實踐提供理論依據(jù)。
【關鍵詞】：miR-345-3p 成骨分化 周期性牽張力 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymalstem cells BMSCs)
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-17
• 實驗一：大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及干性鑒定17-23
• 一、材料與方法17-18
• 二、實驗方法18-21
• 三、結(jié)果與分析21-23
• 實驗二：miR-345-3p在周期性牽張力誘導大鼠BMSC成骨分化過程中的表達變化23-32
• 一、材料與方法23-24
• 二、實驗方法24-30
• 三、結(jié)果與分析30-32
• 實驗三：miR-345-3p在周期性牽張力誘導大鼠BMSCs成骨分化中的功能及其靶基因預測32-40
• 一、材料與方法32-33
• 二、實驗方法33-38
• 三、結(jié)果與分析38-40
• 討論40-45
• 結(jié)論45-46
• 附圖表46-55
• 參考文獻55-60
• 致謝60
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄60-61
• 學位論文評閱及答辯情況表61

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