本文關鍵詞：非損傷微測技術用于口腔鱗癌細胞凋亡機制研究的實驗探索

  更多相關文章： 非損傷微測技術 O_2流 Ca~(2+)流 孟加拉紅 光動力療法 細胞凋亡

【摘要】：目的：非損傷微測技術(Non-invasive micro-test technique,NMT)是一種選擇性微電極技術,可以在不損傷活體樣品的情況下獲得進出樣品的各種離子或分子的多維信息,能夠?qū)崟r選擇性測定進出活體材料離子和小分子流速,該技術具有非損傷性、長時間、多電極、高分辨率、高靈敏度、多角度測量等優(yōu)點,可在不接觸細胞、不干擾細胞活動、不影響細胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機制的條件下,獲得其他技術難以測到的生理特征和生命活動規(guī)律,從而在理論研究和應用領域產(chǎn)生實質(zhì)性的突破,對活體材料進行實時、動態(tài)的測定和研究。將現(xiàn)用于植物生理學研究的非損傷微測技術用于人體細胞生理學研究。應用非損傷微測技術,在不接觸細胞、不干擾細胞活動、不影響細胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機制的條件下,實時測定進出單個口腔鱗癌細胞的離子和小分子流速,獲得腫瘤細胞凋亡時的02和Ca2+流的跨膜變化的動態(tài)信息；應用非損傷微測技術了解孟加拉紅在光動力干預下與口腔鱗癌細胞相互作用時O2和Ca2+流的跨膜特征,以對孟加拉紅在口腔癌診療機制有所了解,有助于對其應用前景進行評估。并為探索非損傷微測技術在醫(yī)學細胞生物學中的進一步應用打下基礎。方法：1.非損傷微測技術實時動態(tài)觀察和記錄單個活的口腔鱗癌細胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流動。2.MTT法檢測不同濃度的孟加拉紅對口腔鱗癌細胞Ca127的細胞毒性,不同濃度的孟加拉紅介導的光動力干預下對口腔鱗癌細胞Ca127的細胞毒性；以及檢測了相同濃度相同激發(fā)光源的條件下,孟加拉紅(10μM)介導的光動力干預下對口腔鱗癌細胞Ca127細胞增殖的抑制作用。3.非損傷微測技術實時動態(tài)檢測孟加拉紅介導光動力干預下誘導的單個口腔鱗癌細胞凋亡時的O2和Ca2+流速變化,以及響應光動力療法誘導的口腔鱗癌細胞凋亡信號通路的研究。(1)熒光探針DCFH-DA檢測孟加拉紅介導的光動力療法激發(fā)的細胞活性氧(ROS)的生成。(2)熒光探針羅丹明123檢測孟加拉紅介導光動力療法誘導的細胞線粒體膜電位(MMP)的變化。(3)Annexin V-FITC/PI雙染檢測孟加拉紅介導的光動力療法誘導的細胞凋亡率。(4)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測孟加拉紅介導光動力療法誘導細胞內(nèi)細胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白的表達水平。(5)非損傷微測技術檢測孟加拉紅介導光動力療法誘導的單個口腔鱗癌細胞凋亡時的02和Ca2+跨膜流動的實時動態(tài)變化。結(jié)果：1.非損傷微測技術實時動態(tài)檢測了單個口腔鱗癌細胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流動,結(jié)果表明Cal27細胞中02在24小時實驗觀察期內(nèi)均為內(nèi)流跨膜移動,分子流的移動速率在16.26 pmole/cm2.s -23.99 pmole/cm2.s之間波動；但Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運動力學特征則表現(xiàn)不同,離子流方向有波動,既有向內(nèi)又有向外的跨膜移動,外流最大移動速率為5.84 pmole/cm2.s,內(nèi)流最大移動速率為3.22pmole/cm2.S。2.實驗結(jié)果顯示孟加拉紅能夠被口腔鱗癌細胞Ca127攝取,進入細胞核和細胞質(zhì)；低濃度的孟加拉紅對口腔鱗癌細胞Ca127沒有細胞毒性；但低濃度的孟加拉紅介導光動力療法對口腔鱗癌細胞Ca127有顯著的細胞毒性,并且對細胞的增值有明顯的抑制作用。3.孟加拉紅介導光動力療法導致口腔鱗癌細胞Ca127細胞內(nèi)釋放大量活性氧,細胞ROS水平顯著增加比未處理組高出2.46倍；細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平在RB-PDT處理后2小時顯示為最高峰,比未處理組高出2.84倍；ROS的釋放導致細胞內(nèi)線粒體膜電位降低,24小時觀察期結(jié)束時僅為39.21%；同時,誘導口腔鱗癌細胞凋亡,凋亡持續(xù)發(fā)生,在RB-PDT處理后2小時,凋亡率出現(xiàn)一個小高峰,達到18.55%：之后逐漸增加,在RB-PDT處理后24小時,達到了30.57%。Western blotting檢測結(jié)果顯示,細胞內(nèi)細胞色素C在光動力激發(fā)后立即釋放出現(xiàn)蛋白表達,Caspase-3、Caspase-9、PARP在觀察期2小時均開始出現(xiàn)蛋白高水平表達。4.非損傷微測技術實時動態(tài)檢測到孟加拉紅介導光動力療法誘導的單個口腔鱗癌細胞Ca127凋亡時的02和Ca2+跨膜流速變化,02流在實時動態(tài)檢測的早期(實驗觀察期的0-2小時)與未處理組、純RB和PDT+NAC處理組的細胞相比較,其分子內(nèi)流移動速率降低,2小時觀察時間點的02流移動速率(6.43pmole/cm2.s)是最小值,后期O2分子內(nèi)流移動速率加大；而Ca2+離子流無論是內(nèi)流還是外流,移動速率都明顯高于未處理組和、純RB和PDT+NAC處理組,2小時觀察時間點的Ca2+離子移動速率(9.53 pmole/cm.s)是Ca2+離子流由外流轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)流的高峰值。這一結(jié)果與上述Annexin V-FITC/PI雙染檢測的細胞凋亡率和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測的蛋白表達的實驗結(jié)果所表達的凋亡時間趨勢是相一致的；2小時是一個關鍵和值得關注的觀察時間點。結(jié)論：1.非損傷微測技術可以用于人體細胞生理學研究,是在不接觸細胞、不干擾細胞活動、不影響細胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機制的條件下研究細胞病理生理學的一種好的方法,在對細胞生理特征和生命活動規(guī)律的研究方面有很大的應用前景。2.成功檢測到Ca127細胞在正常生長代謝過程中O2、Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運動力學特征,為后續(xù)研究打下基礎。3.發(fā)現(xiàn)孟加拉紅在光動力干預下誘導口腔鱗癌細胞凋亡的機制中：內(nèi)活性氧大量釋放、破壞線粒體細胞膜,線粒體膜電位降低,并造成細胞損傷,細胞色素C釋放,激活Caspase級聯(lián)反應；細胞內(nèi)細胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白均相續(xù)出現(xiàn)高表達。通過上述發(fā)現(xiàn),推測O2和Ca2+流的變化響應了光動力作用后通過線粒體依賴性途徑誘導細胞凋亡的信號,可以作為檢測腫瘤細胞凋亡信號的指標；
【關鍵詞】：非損傷微測技術 O_2流 Ca~(2+)流 孟加拉紅 光動力療法 細胞凋亡
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點6-7
• 縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-16
• 文獻綜述(一)16-23
• 文獻綜述(二)23-29
• 引言29-31
• 實驗研究31-80
• 第一部分 非損傷微測技術實時動態(tài)檢測口腔鱗癌細胞的O_2和Ca~(2+)流的實驗研究31-44
• 1 材料32-33
• 2 實驗方法和步驟33-37
• 3 結(jié)果37-38
• 4 討論38-39
• 5 附圖39-44
• 第二部分 孟加拉紅介導光動力療法抑制口腔鱗癌細胞增值的實驗研究44-55
• 1 材料44-45
• 2 實驗方法及步驟45-48
• 3 結(jié)果48-49
• 4 討論49-50
• 5 附圖50-55
• 第三部分 O_2和Ca~(2+)流的變化響應光動力療法誘導的口腔鱗癌細胞凋亡信號的55-80
• 1 材料56-57
• 2 實驗方法及步驟57-64
• 3 結(jié)果64-66
• 4 討論66-71
• 5 附圖71-80
• 參考文獻80-89
• 發(fā)表的研究相關論文89-90
• 附件90-92
• 致謝92-93

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本文編號：804165