發(fā)布時間：2017-08-27 04:27

  本文關鍵詞：炎癥微環(huán)境下組蛋白去乙�；瘜ρ乐苣じ杉毎偕芰Φ挠绊�

  更多相關文章： 組蛋白去乙�；� 牙周膜干細胞 炎癥微環(huán)境 成骨分化 NaB TSA

【摘要】：牙周疾病是口腔最常見的疾病之一,嚴重危害牙周健康和口腔健康,其中牙周炎是一類由牙菌斑生物膜引起的牙周組織的慢性感染性疾病,可引起牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)等牙周支持組織的破壞,導致炎癥發(fā)生及牙周袋形成、進行性附著喪失、和牙槽骨吸收,嚴重時甚至會導致牙齒松動脫落,此外,牙周炎與全身健康也有著密切的關系。目前,尚沒有有效的手段對牙周病進行根治。牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一類存在于牙周組織的間充質(zhì)干細胞,已被證實為牙周組織再生重要的種子細胞。眾所周知,基質(zhì)微環(huán)境的細胞內(nèi)信號和細胞外信號共同調(diào)節(jié)干細胞的自我更新和多向分化潛能,而炎癥不僅改變了干細胞基質(zhì)微環(huán)境的平衡,還能影響其內(nèi)源性信號的調(diào)控作用。研究表明,炎癥微環(huán)境下PDLSCs的再生能力減弱,因此,如何改善或恢復因微環(huán)境改變而引起的PDLSCs下降的成骨能力成為牙周再生的一個新思路。前期研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳機制與微環(huán)境的改變有密切的關系,而組蛋白去乙�；鳛楸碛^修飾中一種重要的調(diào)控機制,在牙周病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。組蛋白去乙�；瘎討B(tài)平衡由組蛋白去乙�；�(Histone deacetylases,HDACs)和組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyl transferases,HATs)共同維持,而組蛋白去乙�；敢种苿�(Histone deacetylase inhibitors,HDACIs/HDIs)被發(fā)現(xiàn)可促進成骨細胞分化成熟,抑制破骨細胞生成和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,對骨再生具有正向調(diào)控作用。因此本實驗首先分別從健康牙周膜組織和牙周炎癥牙周膜組織中分離純化出PDLSCs,比較HDACs在兩種不同來源的干細胞中的表達差異;其次利用HDACIs(NaB和TSA)抑制HDACs功能后,探究其在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs成骨分化和骨形成能力的影響;最后建立大鼠牙周炎模型,檢測NaB和TSA對牙周炎引起的牙槽骨缺失的影響,為探究基于干細胞的牙周組織再生治療提供一種新思路,也為臨床牙周炎的治療探索新的潛在治療藥物。第一部分健康組織和炎癥組織來源的PDLSCs的分離培養(yǎng)與鑒定及生物學特性的研究目的體外分離培養(yǎng)H-PDLSCs和P-PDLSCs,并對兩種細胞的生物學特性進行鑒定和比較。方法(1)有限稀釋法單克隆分離培養(yǎng)獲取正常和慢性炎癥組織來源的PDLSCs(2)流式細胞術檢測兩種間充質(zhì)干細胞的表面分子標志物的表達(3)MTT、克隆形成實驗對兩種間充質(zhì)干細胞的增殖能力進行檢測并比較(4)成骨、成脂分化誘導實驗檢測并比較兩種干細胞的多向分化能力結(jié)果(1)實驗中成功獲取了H-PDLSCs和P-PDLSCs,鏡下觀察均有間充質(zhì)干細胞的形態(tài),有限稀釋法培養(yǎng)有細胞克隆形成,具有自我更新能力。(2)流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,兩種細胞的間充質(zhì)干細胞特異性表面分子標記物STRO-1、CD105、CD90和CD146均為強陽性表達,造血干細胞分子標記物CD34和CD45陰性表達。(3)MTT檢測發(fā)現(xiàn)炎癥組織來源的PDLSCs增殖能力高于正常組織來源的PDLSCs;克隆形成實驗結(jié)果表明,炎癥組PDLSCs克隆形成率明顯高于正常組。(4)成骨、成脂分化誘導實驗結(jié)果顯示,在一定條件下,兩種不同來源的PDLSCs均有骨向分化和脂向分化能力,但炎癥組的PDLSCs成骨分化能力較正常組有明顯的下降,而兩者的成脂分化能力差異并不顯著。結(jié)論(1)H-PDLSCs和P-PDLSCs為間充質(zhì)干細胞,具有自我更新能力和多向分化潛能。(2)炎癥微環(huán)境影響了干細胞的生物學特性,牙周炎癥組織來源的PDLSCs成骨分化能力減弱。第二部分NaB和TSA對P-PDLSCs骨向分化能力的影響目的檢測炎癥微環(huán)境下PDLSCs中HDACs的表達變化,篩選合適濃度的HDACIs(NaB和TSA)進行加藥處理,檢測NaB和TSA抑制HDACs功能后對H-PDLSCs和P-PDLSCs成骨分化能力的影響,并初步探討其所作用的組蛋白乙�；稽c。方法(1)利用RT-PCR技術檢測正常微環(huán)境和炎癥微環(huán)境下PDLSCs中HDAC1-11的表達差異,篩選一種特異性變化的HDAC-X,然后通過Western blot檢測驗證,以此篩選出特異性的HDAC-X,并進行后續(xù)實驗。(2)分別設置NaB和TSA不同的藥物濃度梯度,通過Western blot檢測選擇本實驗應用的合適濃度。(3)MTT法檢測兩種HDACIs對PDLSCs增殖能力的影響,并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。(4)對各組進行成骨分化誘導,通過ALP染色和茜素紅染色比較各組ALP活性和基質(zhì)礦化能力的變化,利用Western blot檢測各組成骨相關蛋白的表達。(5)免疫組織化學分別檢測NaB和TSA在P-PDLSCs細胞膜片中的應用。(6)分別用NaB和TSA處理P-PDLSCs 24h后Western blot檢測HDAC9及下游組蛋白乙�；揎椢稽c的變化。結(jié)果(1)RT-PCR檢測結(jié)果顯示,炎癥微環(huán)境下HDACs的表達普遍升高,以HDAC9的升高最為顯著,Western blot檢測證明P-PDLSCs中HDAC9的蛋白表達增多。(2)利用不同濃度的NaB和TSA處理細胞后,通過Western blot檢測選擇本次實驗的藥物濃度:NaB100μM和TSA100n M。(3)MTT檢測結(jié)果顯示,NaB和TSA對PDLSCs增殖能力無影響;倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好,細胞形態(tài)無異常,鏡下無死細胞形成。(4)通過ALP染色、茜素紅染色和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),NaB和TSA能促進H-PDLSCs和P-PDLSCs的基質(zhì)礦化能力和成骨相關蛋白的表達。(5)免疫組化結(jié)果顯示,NaB和TSA明顯增強P-PDLSCs細胞外基質(zhì)成骨相關指標Runx2的分泌。(6)分別用NaB和TSA作用于PDLSCs后可見HDAC9表達均下降,NaB處理后乙�；M蛋白H3K9、H3K18、H4K16的表達升高,以H4K16的升高最明顯;TSA處理后,可見H3K18表達升高。結(jié)論(1)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中HDACs的表達普遍升高,組蛋白去乙�；癄顟B(tài)失衡。(2)在適宜的安全濃度下,NaB和TSA均能增強H-PDLSCs和P-PDLSCs的成骨分化能力。(3)NaB和TSA作為廣譜的HDACIs,可作用于H4K16、H3K18等乙酰化位點。第三部分NaB和TSA在P-PDLSCs裸鼠體內(nèi)異位移植和SD大鼠原位牙周再生中的研究目的探討NaB和TSA在體內(nèi)異位成骨和原位成骨中的作用。方法(1)制備各組PDLSCs細胞膜片,裸鼠皮下移植8周后取材,經(jīng)HE染色觀察各組新生骨生成情況。(2)利用LPS構(gòu)建SD大鼠牙周炎模型,分別局部注射NaB和TSA,Micro-CT觀察各組牙槽骨缺損的情況。結(jié)果(1)經(jīng)體內(nèi)裸鼠皮下移植實驗結(jié)果顯示,NaB和TSA均可顯著促進P-PDLSCs的新骨生成能力。(2)Micro-CT結(jié)果顯示,NaB和TSA明顯抑制SD大鼠牙周炎引起的牙槽骨缺失。結(jié)論NaB和TSA能顯著改善P-PDLSCs的成骨分化和骨再生能力,并能明顯抑制牙周炎引起的牙槽骨吸收。
【關鍵詞】：組蛋白去乙�；� 牙周膜干細胞 炎癥微環(huán)境 成骨分化 NaB TSA
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻回顧20-29
• 第一部分 健康組織和炎癥組織來源的PDLSCs的分離培養(yǎng)與鑒定及生物學特性的研究29-41
• 1 實驗材料29-31
• 2 實驗方法31-34
• 3 實驗結(jié)果34-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 NaB和TSA對P-PDLSCs骨向分化能力的影響41-65
• 實驗一 HDAC的篩選及NaB和TSA藥物濃度的選擇42-54
• 1 實驗材料42-43
• 2 實驗方法43-48
• 3 實驗結(jié)果48-52
• 4 討論52-54
• 實驗二 NaB和TSA對P-PDLSCs成骨分化能力的影響54-62
• 1 實驗材料54-55
• 2 實驗方法55-57
• 3 實驗結(jié)果57-60
• 4 討論60-62
• 實驗三 NaB和TSA影響P-PDLSCs組蛋白乙�；饔冒悬c的初步探討62-65
• 1 實驗材料62
• 2 實驗方法62-63
• 3 實驗結(jié)果63
• 4 討論63-65
• 第三部分 NaB和TSA在P-PDLSCs裸鼠體內(nèi)異位移植和SD大鼠原位牙周再生中的研究65-73
• 實驗一 NaB和TSA在P-PDLSCs體內(nèi)異位移植實驗中的研究66-69
• 1 實驗材料66
• 2 實驗方法66-67
• 3 實驗結(jié)果67-68
• 4 討論68-69
• 實驗二 NaB和TSA在SD大鼠原位牙周再生中的研究69-73
• 1 實驗材料69
• 2 實驗方法69-70
• 3 實驗結(jié)果70-71
• 4 討論71-73
• 小結(jié)73-75
• 參考文獻75-85
• 個人簡歷和研究成果85-86
• 致謝86

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本文編號：744377