本文關(guān)鍵詞：人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞與人恒牙牙髓干細(xì)胞成骨分化及破骨能力差異以及調(diào)控機(jī)制的初步研究

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【摘要】：[目的]體外分離、培養(yǎng)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞和恒牙牙髓干細(xì)胞,對(duì)比二者一般生物學(xué)特性及成骨誘導(dǎo)和破骨分化能力。篩選并分析SHED參與乳牙牙根生理性吸收過(guò)程的關(guān)鍵因子,初步探討SHED可能參與骨改建的調(diào)控機(jī)制,為干細(xì)胞應(yīng)用于正畸臨床骨改建、加速牙齒移動(dòng)提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]利用酶消化法、有限稀釋法分離純化獲得SHED及DPSCs。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài),細(xì)胞克隆形成率,MTT法測(cè)生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。利用礦化誘導(dǎo)液對(duì)SHED和DPSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo),分別在誘導(dǎo)14天、21天行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色,并對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成骨誘導(dǎo)7d后SHED和DPSCs成破骨相關(guān)基因RUNX2、OCN、COL-1、 ALP. RANKL和OPG的表達(dá)情況,初步探討對(duì)比SHED和DPSCs的成骨分化及破骨能力差異。RT-PCR檢測(cè)SHED和DPSCs的TNF-α、IL-6、NF-κB、OPG、 RANKL表達(dá)情況,Western Bolot檢測(cè)SHED和DPSCs全細(xì)胞蛋白中TNF-α、 NF-κB的表達(dá)水平,并進(jìn)行相關(guān)蛋白表達(dá)灰度分析。[結(jié)果] (1)通過(guò)酶消化法、有限稀釋純化法獲得了SHED和DPSCs,兩種干細(xì)胞的形態(tài)均為成纖維細(xì)胞樣,而SHED呈現(xiàn)多形性,有短梭形、扁平形、多角形和橢圓形等形狀,DPSCs可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞呈梭形、星形,胞漿均勻、核圓、核仁清晰。SHED克隆形成率高于DPSCs,且兩種干細(xì)胞之間存在顯著性差異(p0.05)。SHED和DPSCs的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)均呈“S”型,SHED從第3d開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而DPSCs從第4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,且SHED達(dá)到峰值顯著高于DPSCs,說(shuō)明SHED增殖能力強(qiáng)于DPSCs。細(xì)胞周期分析結(jié)果,G2/M+S期：SHED為35.54%,DPSCs為24.14%,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),提示SHED具有更強(qiáng)的細(xì)胞自我復(fù)制及增殖能力。SHED和DPSCs在成骨向誘導(dǎo)14d后,ALP染色均呈陽(yáng)性表達(dá),且多數(shù)細(xì)胞質(zhì)有藍(lán)紫色顆粒沉淀,SHED比DPSCsALP陽(yáng)性表達(dá)率更高;成骨向誘導(dǎo)21d后,茜素紅染色均為陽(yáng)性,兩種細(xì)胞均可見(jiàn)有礦化結(jié)節(jié)形成,SHED的數(shù)量顯著多于DPSCs,且SHED形成結(jié)節(jié)面積較大、稠密,而DPSCs形成分散、面積較小的礦化結(jié)節(jié)。以上結(jié)果可提示SHED較DPSCs有更強(qiáng)成骨分化能力。(2) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,成骨誘導(dǎo)后,成骨相關(guān)基因Runx2、OCN、ALP和OPG在SHED和DPSCs中均有表達(dá),SHED的Runx2、OCN、ALP和OPG表達(dá)量增加高于DPSCs,該結(jié)果再次證明SHED較DPSCs具有較強(qiáng)成骨分化能力。且兩種細(xì)胞均表達(dá)OPG和RANKL,在破骨相關(guān)基因RANKL的表達(dá)上,與DPSCs相比,SHED呈明顯上調(diào)趨勢(shì),在反應(yīng)細(xì)胞破骨與成骨能力的RANKL/OPG比值上,SHED顯著高于DPSCs,結(jié)果表明,與DPSCs相比,SHED還兼具較強(qiáng)的破骨能力。(3) SHED和DPSCs均表達(dá)TNF-α、 IL-6、NF-κB等炎性相關(guān)因子,SHED在TNF-α、IL-6、NF-κB表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組DPSCs,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);在TNF-a表達(dá)上,SHED表達(dá)量約為DPSCs3倍;在IL-6表達(dá)上,SHED表達(dá)量約為DPSCs 3倍;在NF-κB表達(dá)上,SHED表達(dá)量約為DPSCs7倍;在RANKL/OPG比值上,SHED約為DPSCs的2.5倍,以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 Western Bolot檢測(cè)結(jié)果顯示SHED中TNF-a和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于DPSCs.相關(guān)蛋白表達(dá)灰度分析結(jié)果顯示,在TNF-a表達(dá)上,SHED是DPSCs的大約2.5倍;在NF-κB表達(dá)上,SHED是DPSCs的大約1.9倍,以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p.05)。[結(jié)論]本研究成功從人脫落乳牙牙髓和恒牙牙髓中分離出SHED和DPSCs,與DPSCs相比,SHED增殖能力強(qiáng),倍增時(shí)間短,且具有較高克隆形成能力。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,SHED較DPSCs具有更強(qiáng)的成骨分化能力。此外,SHED還兼有較強(qiáng)的破骨能力。在乳牙生理性根吸收、牙根周?chē)歉慕ǖ倪^(guò)程中,SHED可能通過(guò)分泌TNF-α等炎癥因子誘導(dǎo)活化NF-κB信號(hào)通路,NF-κB信號(hào)通路的激活作用于RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)的調(diào)節(jié),使RANKL/OPG比值明顯變大,促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟以及牙根周?chē)歉慕?從而提示SHED可能參與生理性牙根吸收骨改建,為干細(xì)胞應(yīng)用于正畸臨床骨改建、加速牙齒移動(dòng)提供一定實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞 恒牙牙髓干細(xì)胞 生理性牙根吸收 骨改建 正畸
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R783.5
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一部分 人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞和恒牙牙髓干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究16-32
• 1.1 材料與方法16-20
• 1.2 結(jié)果20-27
• 1.3 討論27-29
• 1.4 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 第二部分 人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞與人恒牙牙髓干細(xì)胞成骨分化及破骨能力差異的實(shí)驗(yàn)研究32-43
• 2.1 材料與方法32-35
• 2.2 結(jié)果35-39
• 2.3 討論39-40
• 2.4 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 第三部分 人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞參與生理性根吸收骨改建的調(diào)控機(jī)制研究43-55
• 3.1 材料和方法43-46
• 3.2 結(jié)果46-50
• 3.3 討論50-51
• 3.4 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 全文總結(jié)55-57
• 綜述57-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況69-71
• 致謝71

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本文編號(hào)：735566