本文關(guān)鍵詞：促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：背景全身系統(tǒng)性疾病或口頜系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的牙周骨組織缺損再修復(fù),是困擾患者更是口腔醫(yī)生的難題,同時(shí)在骨質(zhì)疏松患者中表現(xiàn)尤為明顯。隨著社會(huì)“老齡化”程度的加重,許多由衰老導(dǎo)致的慢性疾病困擾人們的生活與健康。其中婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMO),是骨質(zhì)疏松癥中患病人群最多的一類(lèi)骨代謝性疾病。據(jù)研究報(bào)道,此類(lèi)患者牙槽骨同時(shí)具有骨密度減低、漸進(jìn)性骨破壞以及牙槽嵴高度喪失的病理性改變,使得其牙周骨缺損修復(fù)更是難上加難�？梢�(jiàn),進(jìn)一步了解骨質(zhì)疏松癥的病因并且探索骨質(zhì)疏松條件下的牙周骨缺損修復(fù)的治療途徑具有重要的臨床意義。隨著對(duì)骨質(zhì)疏松癥病因的不斷深入了解,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)被證實(shí)在骨質(zhì)疏松癥宿主體內(nèi)通過(guò)影響骨組織與脂肪組織的改建與形成參與了骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制。但是作為干細(xì)胞在局部發(fā)揮成骨替代效應(yīng)的前提,骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)BMSCs的“歸巢”問(wèn)題應(yīng)被引起關(guān)注。目前尚未有研究對(duì)BMSCs的遷移與歸巢能力是否具有病理性缺陷做出報(bào)道。已被證實(shí)的參與細(xì)胞遷移及歸巢的分子中,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1α)及其受體CXCR4是研究最為廣泛且重要的因子。SDF-1α通過(guò)與其受體CXCR4結(jié)合可以調(diào)控BMSCs的趨化遷移能力,但是尚未有研究對(duì)骨質(zhì)疏松癥的BMSCs與此生物軸的相關(guān)生物學(xué)作用進(jìn)行探討。大量研究證明利用外源性BMSCs的自我增殖以及骨向分化能力治療慢性骨疾病或修復(fù)骨缺損是有效的方法。其中BMSCs的移植方法主要分為系統(tǒng)性移植以及局部移植。局部移植BMSCs是進(jìn)行牙周骨再生常用的組織工程策略,但是具有對(duì)移植環(huán)境及緩釋材料生物性能要求高、植入的細(xì)胞數(shù)量不穩(wěn)定、歸巢至損傷部位數(shù)量較少等缺點(diǎn)。系統(tǒng)性移植BMSCs是骨質(zhì)疏松全身性治療的有效方法,其優(yōu)點(diǎn)是干細(xì)胞在宿主體內(nèi)微環(huán)境的影響下更易隨著血循環(huán)進(jìn)入損傷部位,缺點(diǎn)是有報(bào)道認(rèn)為移植的細(xì)胞會(huì)被大量堆積在肝臟及肺部等。但是目前鮮有研究對(duì)系統(tǒng)性移植BMSCs治療骨質(zhì)疏松牙周骨缺損做出報(bào)道。本研究首次將全身治療骨質(zhì)疏松疾病系統(tǒng)性移植BMSCs的方法與牙周骨缺損的治療相結(jié)合,主要對(duì)SDF-1α/CXCR4生物軸誘導(dǎo)下系統(tǒng)性移植BMSCs修復(fù)牙槽骨損傷的募集作用進(jìn)行評(píng)估,希望通過(guò)局部SDF-1α的誘導(dǎo)作用促進(jìn)外源性BMSCs甚至內(nèi)源性BMSCs的歸巢來(lái)促進(jìn)骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損部位的再生修復(fù)。目的本研究體外實(shí)驗(yàn)首先建立大鼠骨質(zhì)疏松模型,分離培養(yǎng)骨質(zhì)疏松與正常大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,體外比較兩種細(xì)胞的一般生物學(xué)特性以及與SDF-1α/CXCR4軸相關(guān)的生物學(xué)特性,探討此生物軸對(duì)去勢(shì)大鼠BMSCs趨化能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制。為骨質(zhì)疏松疾病對(duì)內(nèi)源性BMSCs的病理性影響提供理論依據(jù)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損模型后,將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的同種正常BMSCs系統(tǒng)移植入大鼠體內(nèi),同時(shí)在缺損局部將SDF-1α與緩釋材料復(fù)合后植入缺損部位,評(píng)價(jià)系統(tǒng)移植BMSCs的局部歸巢以及成骨分化效果。為骨質(zhì)疏松患者的牙周骨缺損及再生修復(fù)提供新的治療途徑及依據(jù)。方法1.建立絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松模型,并用Micro-CT以及力學(xué)方法進(jìn)行模型驗(yàn)證。分離培養(yǎng)來(lái)自正常大鼠(Sham組)與骨質(zhì)疏松大鼠(OVX組)的BMSCs,對(duì)二者的一般生物學(xué)特性,包括克隆形成能力、增殖能力、免疫分子表型、以及成骨與成脂分化能力進(jìn)行鑒定與對(duì)比。2.通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定法、免疫熒光染色法、q RT-PCR、Western-Blot對(duì)上述兩組細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)的CXCR4表達(dá)進(jìn)行鑒定。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)兩組BMSCs在SDF-1α的誘導(dǎo)下趨化遷移能力進(jìn)行對(duì)比;通過(guò)Western-Blot進(jìn)一步對(duì)比兩組BMSCs在SDF-1α誘導(dǎo)下遷移相關(guān)通路AKT以及ERK的磷酸化水平。3.慢病毒轉(zhuǎn)染法上調(diào)OVX-BMSCs的CXCR4表達(dá),通過(guò)q RT-PCR、Western-Blot法對(duì)上調(diào)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證上調(diào)組細(xì)胞遷移能力的變化。4.用SDF-1α局部誘導(dǎo)系統(tǒng)移植的BMSCs來(lái)修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損。建立大鼠牙槽骨缺損模型后,局部植入SDF-1α復(fù)合水凝膠緩釋材料,同時(shí)系統(tǒng)性移植體外標(biāo)記CM-Dil的同種異體BMSCs。4周后,通過(guò)Micro-CT掃描和三維重建技術(shù)對(duì)缺損部位的骨再生進(jìn)行評(píng)價(jià);利用HE及馬松染色觀察微觀骨形成;利用免疫熒光技術(shù)觀察BMSCs在牙槽骨缺損部位的歸巢及分化為成骨基因陽(yáng)性細(xì)胞的情況。進(jìn)一步利用組織PCR技術(shù)檢測(cè)新生骨區(qū)域的相關(guān)成骨標(biāo)志性基因以及CXCR4的表達(dá)。結(jié)果1.(1)經(jīng)Micro-CT及力學(xué)檢測(cè),OVX組比Sham組大鼠股骨的骨組織密度(BMD)、骨礦含量(BMC)、骨小梁比值(BV/TV)以及力學(xué)數(shù)據(jù)最大載荷量(Max Load)都大,證明骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型建立成功。(2)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs一般生物學(xué)特性后結(jié)果顯示:兩者細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)過(guò)程、克隆形成率方面沒(méi)有明顯差異,但OVX-BMSCs較Sham-BMSCs的增殖能力稍強(qiáng)。多向分化能力鑒定結(jié)果顯示:OVX-BMSCS較Sham-BMSCs的成骨分化能力減弱,成脂能力增強(qiáng)。2.(1)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs的CXCR4表達(dá)結(jié)果顯示:CXCR4受體在兩組細(xì)胞均為胞核高表達(dá)、包膜低表達(dá),OVX-BMSCs較Sham-BMSCs低;并且隨著體外培養(yǎng)代數(shù)的增加,兩組細(xì)胞的CXCR4表達(dá)均減弱。(2)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs趨化遷移能力后結(jié)果顯示:兩者細(xì)胞都在SDF-1α為100ng/ml時(shí)的遷移數(shù)量最多;相同SDF-1α濃度下OVX組的遷移能力低于Sham組;CXCR4受體阻斷劑AMD3100可明顯降低兩種細(xì)胞的遷移速率,說(shuō)明CXCR4與OVX-BMSCs的遷移密切相關(guān)。(3)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs在SDF-1α誘導(dǎo)下AKT與ERK通路的磷酸化水平。AKT結(jié)果顯示:Sham組在30min時(shí)磷酸化水平顯著上升達(dá)到最大值,60分鐘時(shí)開(kāi)始下降;而OVX組則在30-60min之間,甚至60min時(shí)出現(xiàn)磷酸化水平的最高點(diǎn)。ERK結(jié)果顯示:Sham組也在30min時(shí)ERK磷酸化水平明顯升高,60min時(shí)稍降低,120min時(shí)較60min沒(méi)有明顯變化;而OVX組在60min時(shí)磷酸化水平明顯增高,120min與60min時(shí)不具明顯差異。相同時(shí)間點(diǎn)比較時(shí)發(fā)現(xiàn),加抑制劑組比未加抑制劑組的AKT及ERK磷酸化水平明顯降低,并且在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的磷酸化與上述不加抑制劑組趨勢(shì)相似。以上說(shuō)明OVX組的AKT與ERK磷酸化水平及敏感度較Sham組減弱,并且這一過(guò)程與CXCR4的表達(dá)密切相關(guān)。3.上調(diào)OVX-BMSCs的CXCR4表達(dá)后遷移能力檢測(cè):熒光顯微鏡下觀察EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs陽(yáng)性率大于80%以上,q RT-PCR與Western blot證明上調(diào)組BMSCs的CXCR4m RNA及蛋白水平明顯升高。趨化遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CXCR4-OVX-BMSCs體外遷移能力明顯升高。4.(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:移植手術(shù)4周后用Micro-CT對(duì)新生骨組織進(jìn)行CT值分析以及BMD分析,結(jié)果顯示系統(tǒng)性移植組(im-BMSCs)組比空白對(duì)照組骨再生情況較佳;局部誘導(dǎo)組(SDF-1α+im-BMSCs)骨再生情況明顯優(yōu)于im-BMSCs及空白對(duì)照組。(2)HE染色及馬松三色染色結(jié)果顯示:SDF-1α+im-BMSCs組新骨內(nèi)有更多的富含膠原的新骨及成骨細(xì)胞,而單純im-BMSCs與空白對(duì)照組的纖維結(jié)締組織較多。(3)免疫熒光染色結(jié)果顯示:SDF-1α+im-BMSCs組較im-BMSCs組與空白對(duì)照組局部歸巢的細(xì)胞明顯增多,且SDF-1α+im-BMSCs組歸巢至局部的細(xì)胞表達(dá)成骨基因Runx2及OCN的陽(yáng)性表達(dá)增多,說(shuō)明更多的BMSCs發(fā)生了成骨分化。(4)組織PCR結(jié)果顯示,SDF-1α+im-BMSCs較空白對(duì)照及im-BMSCs組Runx2及OCN的表達(dá)升高,并且CXCR4的表達(dá)也升高顯著,提示SDF-1α+im-BMSCs組牙槽骨缺損再生的新骨組織募集了大量的CXCR4陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。結(jié)論1.OVX-BMSCs較Sham-BMSCs的增殖能力增強(qiáng),成骨能力減弱,成脂能力增強(qiáng)。SDF-1α誘導(dǎo)后OVX-BMSCs較Sham-BMSCs的體外遷移能力較弱,與其CXCR4的表達(dá)降低有關(guān)。上調(diào)OVX-BMSCs表面的CXCR4基因,可以增強(qiáng)其體外遷移能力。2.局部植入SDF-1α緩釋水凝膠可以增加系統(tǒng)性移植BMSCs向骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損歸巢的數(shù)量,并且通過(guò)成骨分化后參與局部骨組織的修復(fù)與再生;局部SDF-1α的移植也可能引起內(nèi)源性BMSCs的歸巢。
【關(guān)鍵詞】：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 SDF-1α/CXCR4 AMD3100 細(xì)胞歸巢 成骨分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R580;R783
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 前言19-21
• 文獻(xiàn)回顧21-43
• 第一部分 正常（Sham）與PMO大鼠（OVX）BMSCs的一般生物學(xué)特性比較43-62
• 實(shí)驗(yàn)一 大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立與驗(yàn)證43-46
• 1 材料43
• 2 方法43-44
• 3 結(jié)果44-46
• 實(shí)驗(yàn)二 Sham-BMSCS與OVX-BMSCS的分離、培養(yǎng)、及鑒定46-62
• 1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 2 實(shí)驗(yàn)方法47-52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-60
• 4 討論60-62
• 第二部分 正常（Sham）與PMO大鼠（OVX）BMSCs遷移能力比較62-81
• 實(shí)驗(yàn)一 Sham-BMSCS與OVX-BMSCS表達(dá)CXCR4受體水平的鑒定63-71
• 1 實(shí)驗(yàn)材料63-64
• 2 實(shí)驗(yàn)方法64-66
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-69
• 4 討論69-71
• 實(shí)驗(yàn)二 體外對(duì)比Sham-BMSCS與OVX-BMSCS趨化遷移能力71-75
• 1 實(shí)驗(yàn)材料71
• 2 試驗(yàn)方法71-72
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果72-73
• 4 討論73-75
• 實(shí)驗(yàn)三 Sham-BMSCS與OVX-BMSCS相關(guān)AKT與ERK通路磷酸化水平的研究75-81
• 1 實(shí)驗(yàn)材料75
• 2 實(shí)驗(yàn)方法75-76
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-79
• 4 討論79-81
• 第三部分 基因轉(zhuǎn)染提高PMO大鼠BMSCs趨化能力的研究81-86
• 1 實(shí)驗(yàn)材料81
• 2 實(shí)驗(yàn)方法81-82
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果82-84
• 4 討論84-86
• 第四部分 促進(jìn)BMSCs歸巢修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損的體內(nèi)研究86-102
• 1 實(shí)驗(yàn)材料86-87
• 2 實(shí)驗(yàn)方法87-91
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果91-99
• 4 討論99-102
• 小結(jié)102-104
• 參考文獻(xiàn)104-125
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果125-127
• 致謝127

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9 羅朵生;調(diào)肝啟樞化濁法治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥代謝組學(xué)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

10 吳穹;DKK1合成多肽對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥和成骨作用的研究[D];南京大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王小華;老年人骨質(zhì)疏松的影響因素分析[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 張沖;石家莊市在校女大學(xué)生綜合骨評(píng)價(jià)值現(xiàn)況調(diào)查及影響因素分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 林葳;成年豬椎體類(lèi)骨質(zhì)疏松性生物力學(xué)模型的快速建立[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王婧;老年慢性心力衰竭患者骨質(zhì)疏松的臨床分析[D];石河子大學(xué);2015年

5 王雪潔;2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松癥的影響因素分析及超聲診斷的應(yīng)用價(jià)值[D];石河子大學(xué);2015年

6 余光書(shū);補(bǔ)腎健脾方對(duì)骨質(zhì)疏松性髖部骨折術(shù)后肌力與骨量的影響[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 李明;慢性風(fēng)濕免疫病兒童骨質(zhì)疏松癥的臨床分析暨危險(xiǎn)因素探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

8 祁宇軒;磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像技術(shù)在骨質(zhì)疏松診斷中的應(yīng)用價(jià)值[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 高宇;QCT測(cè)量骨質(zhì)疏松癥及其影響因素的相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 王姍姍;磷酸化南極磷蝦肽增加骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度及其作用機(jī)制研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：700369