目的:探討體外聯(lián)合應(yīng)用VEGF和PDGF-BB兩種細(xì)胞生長因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成血管不同階段相關(guān)基因指標(biāo)mRNA表達(dá)量的影響,為優(yōu)化組織工程干細(xì)胞提供理論依據(jù)。方法:體外分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,根據(jù)分組:VEGF組、PDGF-BB組、VEGF+PDGF-BB組及對照組,分別用不同濃度VEGF（0、20、40、60、80、100、120 ng/mL）和PDGF-BB（0、20、40、60、80、100、120 ng/mL）單獨或聯(lián)合干預(yù)BMSCs,連續(xù)7天檢測細(xì)胞增殖能力,確定最佳促細(xì)胞增值濃度。使用最佳促細(xì)胞增殖濃度,根據(jù)分組干預(yù)BMSCs 7天和14天后,提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR檢測四組細(xì)胞Ang-1、Hif-1α、HGF、IGF成血管基因的表達(dá)量。結(jié)果:（1）加入生長因子后,細(xì)胞增殖能力明顯提高,單獨作用效果不如聯(lián)合作用的效果,最佳濃度組組合為:80 ng/mL VEGF+80 ng/mL PDGF-BB。（2）mRNA表達(dá)水平,在第7天及第14天這兩個檢測點,除了對照組,其他三組Ang-1、Hif-1α、HGF、IGF基因指標(biāo)的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào),差... 

【文章來源】：新疆醫(yī)科大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

原代第3天、原代第7天、第一代、第二代、第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)圖（×5）

加入生長因子干預(yù)7天后各組細(xì)胞形態(tài)圖（×5）

新疆醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文22樣，每管為20μL體系。上普通PCR機(jī)，按照產(chǎn)品說明書程序設(shè)置，擴(kuò)增目的基因，大約47min后擴(kuò)增結(jié)束。吸取得到的產(chǎn)物5μL用于后續(xù)凝膠電泳實驗。（2）凝膠電泳：制膠、電泳方法同前。Rat大鼠Ang-1、Hif-1α、HGF、IGF基因引物片段大小分別為165bp、146bp、162bp、156bp。因此，我們最終選擇Maker600用于凝膠電泳標(biāo)記引物片段大小，連接好電泳系統(tǒng)后，聯(lián)通電源，開始電泳，大概15-25min左右，條帶即可跑到制膠板的中央。去除膠塊，上凝膠成像拍照系統(tǒng)拍照，得到的結(jié)果顯示用maker標(biāo)尺，凝膠電泳各基因片段的表達(dá)條帶與最初引物設(shè)計長度完全相符，且條帶較亮且均勻。結(jié)果見圖5。圖5引物準(zhǔn)確性和特異性的檢驗Fig.5Testoftheaccuracyandspecificityofprimers4.3實時熒光定量RT-PCR結(jié)果分析利用普通PCR儀，通過Touchdown實驗方法，確定最佳退火溫度及最佳延伸時間，利用最佳條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。在對熒光定量PCR結(jié)果分析時，一般需要看三個地方：基線、CT值和溶解曲線�；�是指在熒光定量PCR反應(yīng)最初，熒光信號變化不大，幾乎接近是一條直線。一般情況下，CT值越小說明起始拷貝數(shù)越大。CT值代表了每個PCR反應(yīng)管到達(dá)程序設(shè)置的熒光信號值時所需要經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。而溶解曲線則在一定程度上代表了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，若溶解曲線圖是單峰，那么引物特異性高。RT-PCR結(jié)果見圖6-9。

【參考文獻(xiàn)】：
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