牙齦卟啉單胞菌是牙周病,尤其是慢性牙周炎病變區(qū)最主要的優(yōu)勢細菌,是目前公認的牙周病致病菌。其毒力因子主要包括外膜上的纖毛、脂多糖、外膜膜泡,多種胞外蛋白酶、內(nèi)毒素、磷酸酶等。而酪氨酸蛋白酶（Tyrosine protein phosphatase,Ltp1）被鑒定為主要的毒力因子之一,但是其致病機制未知。目的:構(gòu)建牙齦卟啉單胞菌中Ltp1基因的原核表達系統(tǒng),表達和純化目的蛋白Ltp1,同時對目的蛋白進行晶體學初篩,嘗試優(yōu)化蛋白晶體,并通過X射線晶體衍射的方法解析結(jié)構(gòu),基于結(jié)構(gòu)闡明Ltp1的生物學功能和致病機理。材料與方法:直接合成Ltp1目的基因片段,然后通過重組法,將目的基因片段構(gòu)建于帶有組氨酸（His）標簽的p ET29質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21（DE3）感受態(tài)中,以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）誘導感受態(tài)過表達目的蛋白Ltp1,然后以鎳柱親和層析和分子篩對目的蛋白進行純化,通過免疫印跡法分析鑒定其免疫原性;利用硝基苯磷酸鹽（p-Nitrophenyl phosphate,... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

pET-29a表達載體圖譜

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文pET-29a-c(+)載體攜帶N端STag/凝血酶構(gòu)型和可選的C端HisTag序列。環(huán)狀序列質(zhì)粒圖譜上顯示其獨特的位點。注意，該序列是按pBR322質(zhì)粒的編碼規(guī)則進行編號的，因此T7蛋白表達區(qū)在質(zhì)粒圖譜上是反序的。由T7RNA聚合酶啟動的克隆和表達區(qū)如上圖所示。而且F1復制子是定向的，因此在T7噬菌體聚合酶（T7啟動子）作用下，包括：蛋白序列編碼病毒粒子的產(chǎn)生，以啟動蛋白表達；而終止則是由T7終止子完成圖2-2pET-29a序列標志Fig2-2pET-29asequencelandmarks表達菌株：大腸桿菌E.coliBL21(DE3）2.1.2實驗試劑與溶液（1）引物合成：根據(jù)Genebank上查詢所得目的基因片段，對其進行優(yōu)化，同時設(shè)計引物（均是通過軟件PrimerPremier5輔助完成的），完成后發(fā)送給安徽通用系統(tǒng)生物有限公司進行合成。（目的基因該公司直接構(gòu)建在了其公司默認使用的pET19-b載體上）引物：上游引物pg1641-S：5’-AGGAGATATACATATGAAGCCGCATAAAATTCTGTT-3’；下游引物pg1641-A：5’-GGTGGTGGTGCTCGAGATCGCAGGCGCTCAGACTAC-3’。

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文圖1pg1641菌液PCR后DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig1DNAagarosegelelectrophoresisofpg1641afterPCRM：DNAMarker；1、2、3、4、5、6：菌液PCR后目的基因pg1641圖2測序結(jié)果對比Fig2Comparisonofsequencingresults

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3091542