目的：本課題擬構(gòu)建靶向人Trb3的shRNA真核表達載體及穩(wěn)定表達Trb3 shRNA的舌鱗狀細胞株,檢測其對靶基因的沉默效果、觀察其對舌鱗癌細胞Tca8113增殖和凋亡的影響,并初步探討其機制。方法：運用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶向人Trb3 shRNA載體pSUPER-shTrb3;逆轉(zhuǎn)錄病毒方法建立穩(wěn)定干擾內(nèi)源性Trb3基因的舌鱗癌細胞株；Western Blot、Real-timePCR技術(shù)檢測靶基因Trb3的表達情況,流式細胞術(shù)檢測細胞增殖及凋亡情況,Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果：酶切及測序證實成功構(gòu)建了靶向人Trb3基因的shRNA真核表達載體,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒方法成功建立了穩(wěn)定表達Trb3 shRNA的舌鱗癌細胞株,Real-time PCR、Western Blot證實重組質(zhì)粒組細胞Trb3 mRNA和蛋白表達水平相對于空載體細胞組顯著下降（P<0.05）。流式細胞術(shù)證實在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下干擾內(nèi)源性Trb3可促進舌鱗癌細胞增殖,抑制細胞凋亡,同時凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase 3、7、cleaved-PARP表達下調(diào)。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒psUPER一sh介h3酶切鑒定M:oL15000Marker:l:PsUPER一vector:2:shTrb3#l:3:shTrb3#2:4:shTrb3#3

GAPDH月...月.，3‘r.卜那1川礴 2..礴3圖SW七 stcrnBlot檢測各組細胞Trb3蛋白表達水平 Ser:Tcas113一ser細胞;sh#l:TCasll3一sh#3細胞(P值scr Tcas113一sh#l細胞 :sh#2:Tcas113一sh#2細胞;sh#3: vssh#l:0.024;servssh#2:0.015;scrvssh#3:0.038)

擾效果明顯，可以用于下一步實驗研究。選用干擾效果較好的細胞 Tcas113一sh#2、 Tcas113·sh#3及對照細胞 Tcas113一scr。圖6顯示的是在ERS條件下干擾內(nèi)源性Trb3基因舌鱗癌細胞的增殖系數(shù)。圖6A為剛被染色的原代細胞 Tcas113，其熒光強度最強。細胞被染色后繼續(xù)培養(yǎng)，隨著細胞分裂，CFSE被平均分配至子代細胞中而使細胞的平均熒光強度減弱。細胞經(jīng)過培養(yǎng)后，分裂的細胞越多，平均熒光強度就越弱。該組圖橫坐標為細胞熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)，根據(jù)細胞熒光強度的分布圖，可得出細胞的增殖系數(shù)。細胞平均熒光強度越小，增殖系數(shù)越大，表明細胞增殖越快。該組圖顯示，圖 6B:Tcas113一ser細胞組細胞增殖系數(shù)為 12.41;圖6C:干擾腸b3后的 Tcas113-sh#2細胞組細胞增殖系數(shù) 31.10;圖6D:干擾腸b3后的 Tcas113一sh#3細胞組細胞增殖系數(shù)為30.68，證明在ERS條件下


本文編號：2994030