目的 牽張成骨(distraction osteogenesis,DO)是利用骨創(chuàng)傷后骨痂愈合機(jī)理產(chǎn)生新骨的一項(xiàng)內(nèi)源性骨組織工程技術(shù),已成為國內(nèi)外口腔頜面外科研究的熱點(diǎn)之一,并且隨著近幾年來的大量基礎(chǔ)和臨床研究,展現(xiàn)了該技術(shù)在顱頜面整形、腫瘤術(shù)后重建、牙槽種植等方面廣闊的應(yīng)用前景。盡管DO技術(shù)具有傳統(tǒng)手術(shù)難以比擬的優(yōu)勢,但過長的牽張和固定時間,以及由此而產(chǎn)生的諸多并發(fā)癥是限制其臨床應(yīng)用的主要原因。如何提高DO過程中新骨形成的速度和質(zhì)量,縮短DO治療時間,減少并發(fā)癥的發(fā)生是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究的目的是擬通過RT-PCR技術(shù)從人骨肉瘤中提取并擴(kuò)增hBMP-2基因片段,通過酶切技術(shù)將其插入pcDNA3.1構(gòu)建成真核表達(dá)載體,利用基因轉(zhuǎn)染方法將其導(dǎo)入兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),并檢測其在MSCs中的表達(dá)情況。然后將BMP-2基因修飾的自體MSCs植入兔下頜牽張成骨區(qū),通過細(xì)胞可控地在需要的時段持續(xù)表達(dá)BMP-2,誘導(dǎo)MSCs自身或牽張成骨區(qū)的多潛能干細(xì)胞以及可能的成纖維細(xì)胞向成骨或成軟骨細(xì)胞分化,模擬胚胎骨形成或骨折愈合的自然發(fā)生過程,使成骨級聯(lián)再次啟動,重續(xù)定向成骨分化,最終達(dá)到促進(jìn)牽張成骨新骨形成與改建,從而大大縮短牽張成骨治療周期,為進(jìn)一步在臨床上廣泛使用牽張成骨技術(shù)治療各種骨創(chuàng)傷或骨缺損奠定基礎(chǔ)。 方法 1取2-3月齡健康新西蘭白兔,穿刺抽取雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子部位骨髓約4-6 ml,采用貼壁分離法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞表面抗原檢測對細(xì)胞進(jìn)行鑒定;并向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng),通過鈣鉆法檢測堿性磷酸酶表達(dá),茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成能力。 2采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù),從人骨肉瘤中擴(kuò)增出人骨形成蛋白-2基因片段,通過DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pcDNA 3.1真核表達(dá)載體上,構(gòu)建成pcDNA3.1- hBMP-2重組質(zhì)粒。通過用PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析及DNA測序的方法對重組DNA進(jìn)行鑒定。 3采用比較成熟的脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),將含人BMP-2編碼序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BMSCs,通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫印跡法(westernblot)以及免疫組化等手段檢測BMP-2-mRNA及其蛋白的表達(dá)。 4取健康新西蘭白兔36只隨機(jī)分為3組,每組12只。實(shí)驗(yàn)組(注射BMP-2基因修飾的自體MSCs)、對照組(注射自體MSCs)、空白組(注射生理鹽水)。術(shù)前3-4周分別根據(jù)編號對實(shí)驗(yàn)組及對照組動物自脛骨上端穿刺抽取骨髓,并做好對應(yīng)編號進(jìn)行傳代培養(yǎng),將兔自體MSCs培養(yǎng)傳代至第P3代細(xì)胞后用hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾。建立牽張成骨動物模型,術(shù)后延遲期為5天,從術(shù)后第6天開始牽張,每天2次,每次0.5mm牽張,牽張長度7mm,隨后固定。在固定期第2天,實(shí)驗(yàn)組于牽張間隙注射200μl的自體BMP-2基因修飾的自體MSCs液;對照組注射200μl的自體MSCs液;空白組注射200μl生理鹽水。分別于牽張結(jié)束固定2w、6w分別攝X線片觀察骨質(zhì)愈合、改建情況;在固定術(shù)后2周、6周各實(shí)驗(yàn)組分別處死動物6只,通過大體病理、HE染色組織切片及掃面電鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組新骨形成情況,并通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫組化等手段檢測BMP-2-mRNA及其蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 1兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo): MSCs剛分離接種時,其內(nèi)血細(xì)胞混雜,成分不易分辨。3天后首次換液,可見貼壁細(xì)胞呈三角形、成纖維形、多角形或短梭形外觀,培養(yǎng)10-20天后細(xì)胞長滿瓶底,可見成纖維樣細(xì)胞克隆樣增殖,成片生長。傳代后觀察:傳代后細(xì)胞增殖速度明顯加快,細(xì)胞排列整齊有序。使用條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)2周,細(xì)胞呈集落生長后開始形成鈣結(jié)節(jié),茜素紅染色陽性,證明MSC已被誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞。 2經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析和DNA測序證實(shí),本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒目的基因片段為人BMP-2-cDNA。 3通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核轉(zhuǎn)染方法能成功將外源hBMP-2基因轉(zhuǎn)入兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并經(jīng)RT-PCR、免疫組化和蛋白印跡法證實(shí),轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hBMP-2后的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)有大量hBMP-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)。 4動物實(shí)驗(yàn):于牽張結(jié)束固定2w、6w取標(biāo)本,通過大體病理觀察,從新生骨表面看,從質(zhì)量或者硬度上由高到低排列為:實(shí)驗(yàn)組對照組=空白組;通過X線觀察并經(jīng)過灰度值統(tǒng)計(jì)軟件分析,在固定期第2周及6周實(shí)驗(yàn)組牽張區(qū)骨密度明顯高于對照組和空白組(p0.01),在各期對照組和空白組牽張區(qū)骨密度比較未見明顯差異(p0.05 );固定2w、6w通過RT-PCR檢測并通過電泳圖像灰度值分析,實(shí)驗(yàn)組BMP-2mRNA相對光密度值顯著高于對照組和空白組(P0.01),而對照組和空白組BMP-2mRNA表達(dá)差別不大(P0.05);通過免疫組化顯示:實(shí)驗(yàn)組固定2周、6周牽張間隙新生骨組織中均可見BMP-2強(qiáng)陽性表達(dá),實(shí)驗(yàn)組平均灰度值低于對照組和空白組(P0.01),而對照組和空白組間無差別(P0.05)。 結(jié)論 1全骨髓貼壁換液方法是一種簡單實(shí)用的分離培養(yǎng)方法,可獲得純度較高的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;原代和傳代保持了較高的增殖活力,經(jīng)過誘導(dǎo)后可向成骨細(xì)胞分化,選取組織工程種子細(xì)胞以3代以前較為適宜。 2成功構(gòu)建了人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hBMP-2,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 3通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核轉(zhuǎn)染方法可以將外源hBMP-2基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并使其獲得較為穩(wěn)定的表達(dá)。 4用BMP-2基因修飾的自體MSCs移植能有效促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨新骨形成,為臨床上縮短牽張成骨治療周期提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R782
【部分圖文】：

2.細(xì)胞培養(yǎng)圖 1-1 耳緣靜脈注射麻醉Fig 1-1 Anesthetization by the vein of ear rim圖 1-2 常規(guī)消毒雙側(cè)脛骨上端皮膚Fig 1-2 Sterilization of the skin of superiorextremity of bilateral tibias圖 1-3 骨髓穿刺Fig 1-3 Bone marrow aspiration圖 1-4 抽取骨髓Fig 1-4 Bone marrow extraction

2.細(xì)胞培養(yǎng)圖 1-1 耳緣靜脈注射麻醉Fig 1-1 Anesthetization by the vein of ear rim圖 1-2 常規(guī)消毒雙側(cè)脛骨上端皮膚Fig 1-2 Sterilization of the skin of superiorextremity of bilateral tibias圖 1-3 骨髓穿刺Fig 1-3 Bone marrow aspiration圖 1-4 抽取骨髓Fig 1-4 Bone marrow extraction

162.細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞接種于 5OmI 培養(yǎng)瓶，加入 DMEM 全培養(yǎng)液(以蓋過瓶底為度)，在 370C， 5%C02，濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.細(xì)胞純化接種后 60-80 分鐘，換液去除大部分懸浮細(xì)胞，加入全培養(yǎng)基 4-6ml，然后靜置原代培養(yǎng) 3 -4 天，半量換液，第 7 天全量換液，培養(yǎng)過程中倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，觀察到紡錘型成纖維樣細(xì)胞克隆形成后，說明MSCs 進(jìn)入增殖期，這時每天換液，在原代培養(yǎng) 15 -20 天左右。觀察到成片的成纖維樣形態(tài)的細(xì)胞克隆，在瓶底用 Marker 筆標(biāo)記，0.25%胰酶消化，圖 1-3 骨髓穿刺Fig 1-3 Bone marrow aspiration圖 1-4 抽取骨髓Fig 1-4 Bone marrow extraction
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2861939