目的:明確miR-504對口腔癌細胞Tca-8113中細胞生物學行為的影響,包括細胞增殖、遷移、侵襲、平板克隆和凋亡,進行下游靶基因的篩選和驗證。探討miR-504在Tca-8113生物學行為中所發(fā)揮的作用與相關(guān)調(diào)節(jié)機制,為深入理解口腔癌發(fā)病分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎。方法:(1)本實驗通過轉(zhuǎn)染人工合成的miR-504模擬物和無關(guān)序列NC來調(diào)節(jié)miR-504在口腔癌細胞Tca-8113中表達水平,進而研究miR-504在口腔癌細胞Tca-8113中所起的作用。通過RT-qPCR檢測miR-504在口腔癌細胞Tca-8113中表達水平的差異。以轉(zhuǎn)染無關(guān)序列NC的Tca-8113細胞作為對照。(2)上調(diào)miR-504在口腔癌細胞Tca-8113中的表達水平,通過口腔癌細胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力、平板克隆能力以及細胞凋亡來評價miR-504的作用。(3)通過在線microRNA靶基因預測工具(miRanda,Target Scan和miRTarBase)預測miR-504的靶基因,雙熒光素酶實驗進行驗證,Western blotting對靶基因進行檢測。(4)通過Western blotting和RT-qPCR對miR-504抑制口腔癌細胞Tca-8113增殖機制進行初步探討。結(jié)果:(1)RT-qPCR檢測miR-504的表達,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-504模擬物后,與NC組相比miR-504的表達水平顯著提高(P0.01)。(2)上調(diào)口腔癌細胞miR-504的表達水平后,與NC組相比細胞增殖能力、細胞遷移能力、細胞侵襲能力、細胞平板克隆能力顯著被抑制,細胞凋亡能力無顯著性差異。(3)生物信息學技術(shù)預測miR-504的靶基因,最終選定CDK6為靶基因進行后續(xù)實驗。(4)雙熒光報告基因顯示轉(zhuǎn)染miR-504后構(gòu)建的熒光報告基因載體Wt CDK6-3'UTR活性明顯降低。(5)Western Blotting結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-504后,CDK6蛋白表達量明顯下調(diào)。(6)E2F1、Cyclin D1和Beclin 1在miR-504過表達組較陰性對照組蛋白表達量明顯下調(diào),p21在miR-504過表達組較陰性對照組蛋白表達量明顯上調(diào)。結(jié)論:本研究以口腔癌中miR-504的異常表達為切入點,探討miR-504在口腔癌中的作用以及調(diào)節(jié)機制,miR-504高表達抑制口腔癌細胞體外增殖、遷移、侵襲和平板克隆能力,在口腔癌細胞中可能扮演著抑癌角色,明確了miR-504與CDK6的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系,可為臨床治療口腔癌提供一種新的思路及理論依據(jù)。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

注：與對照組比較*p<0.05，**p<0.01。圖2.1 瞬時轉(zhuǎn)染miR-504 mimics后Tca-8113細胞miR-504 mRNA 表達變化2.2 miR-504-5p 可抑制口腔癌細胞增殖表 2.1 調(diào)節(jié) miR-504 表達水平對 Tca8113 細胞活力的影響Groups oh 24h 48h 72hControl 0.512±0.060 1.071±0.111 1.924±0.073#2.795±0.041##10nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.766±0.063 1.216±0.065**##1.894±0.094**##50nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.594±0.022 1.088±0.081**##1.597±0.107**##100nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.598±0.008 0.999±0.007**##1.543±0.017**##NC 0.512±0.060 0.790±0.041 1.748±0.094* 2.715±0.156注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 NC 組比較，#P<0.05，##P<0.01。

實驗結(jié)果顯示，miR-504 mimics 作用于細胞后，細胞生別是處理 48h 和 72h。與對照組相比，miR-504 mimic（P<0.01），說明上調(diào) miR-504 表達可抑制細胞增殖，降1 和圖 2.2。2 可以看出，100nM miR-504 Mimics group 轉(zhuǎn)染 48h 后定這一條件進行后續(xù)實驗。表 2.2 調(diào)節(jié) miR-504 表達水平對 Tca8113 細胞增殖率的影響ps 24h 增殖率 48h 增殖率 Mimics group 71.52%±12.30% 63.20%±12.50% 6 Mimics group 55.46%±8.20% 56.55%±14.10% 5 Mimics group 55.84%±6.80% 51.92%±6.70% 73.76%±10.10% 90.85%±15.40% 9

山西醫(yī)科大學碩士學位論文表 2.3 調(diào)節(jié) miR-504 表達水平對 Tca8113 細胞遷移的影響組別 細胞數(shù) 相對倍數(shù) 遷移率CON 73.00 10.88 /NC 65.80 8.33 0.90 0.11 90%MI 20.00 3.35**##0.27 0.05 27%注：MI 組與 CON 組相比，**P<0.01；MI 組與 NC 組相比，##P<0.01；NC 組與 CON 組相比，無差異。
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本文編號：2857389