牙周炎等多種原因造成的牙周支持組織喪失是成人牙齒脫落的首要原因，牙周炎的治療和牙周缺損的修復(fù)是全世界關(guān)注的難題。雖然目前臨床常見(jiàn)牙周治療方法如潔治術(shù)、刮治術(shù)、翻瓣術(shù)等，能夠控制牙周炎癥的進(jìn)展和阻止牙周支持組織的進(jìn)一步喪失，卻不能使缺失的組織獲得良好的再生；引導(dǎo)組織再生術(shù)和植骨術(shù)的興起，給牙周炎的治療帶來(lái)新的希望，但適應(yīng)范圍狹窄、療效不穩(wěn)定且可預(yù)見(jiàn)性差。近年來(lái)，組織工程研究取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使利用組織工程的原理、技術(shù)和方法實(shí)現(xiàn)牙周組織再生成為可能。自2004年美國(guó)學(xué)者從人牙周膜組織中成功分離出牙周韌帶干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）以來(lái)，利用干細(xì)胞移植（stem celltransplantation）技術(shù)修復(fù)牙周組織缺損成為牙周組織再生研究的主要策略。在大動(dòng)物對(duì)照試驗(yàn)研究中，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）和PDLSCs修復(fù)牙周組織缺損都取得了很好的效果。2010年，世界上首篇將自體牙周膜來(lái)源的細(xì)胞用于牙周炎的臨床治療，文章發(fā)表在Oral Diseases上，將牙周細(xì)胞治療的研究和臨床應(yīng)用推進(jìn)到一個(gè)從所未有的高度。 為了加快牙周細(xì)胞治療的臨床轉(zhuǎn)化，選擇適用范圍廣、操作簡(jiǎn)便、安全有效、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的細(xì)胞輸送（cell delivery）方法成為我們必需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。研究表明，利用細(xì)胞膜片（cell sheet）技術(shù)可以保留細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)形成的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）和細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接，從而避免外源性生物材料的應(yīng)用，提高細(xì)胞移植的植活率。同時(shí)良好的生物相容性、可操作性、可量化控制、調(diào)節(jié)膜片的大小和厚度，使得細(xì)胞膜片技術(shù)成為細(xì)胞移植（cell transplantation）首選方法之一。1993年，日本學(xué)者Okano等建立了溫度敏感性培養(yǎng)皿制備細(xì)胞膜片的方法，隨后國(guó)內(nèi)外學(xué)者就如何簡(jiǎn)便獲得高效的細(xì)胞膜片方面進(jìn)行了大膽的嘗試。本實(shí)驗(yàn)室2010年報(bào)道了通過(guò)維生素C誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得細(xì)胞膜片的方法，使細(xì)胞膜片的制備變得更加簡(jiǎn)單。進(jìn)一步深入探索安全有效且簡(jiǎn)便易行的膜片改良技術(shù)可以加速細(xì)胞治療牙周病的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。證據(jù)表明，中草藥中具有多種生物活性分子，這些活性成分有望成為生長(zhǎng)因子的替代品，用于細(xì)胞生物學(xué)性能的體內(nèi)外調(diào)節(jié)研究中。天然化合物蛇床子素（Osthole）是從蛇床、歐前胡等傳統(tǒng)中草藥中提取的香豆素類(lèi)化合物，價(jià)格便宜、制備簡(jiǎn)單；體內(nèi)外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)細(xì)胞的增殖和骨向分化能力，可以有效的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。因此，在細(xì)胞膜片制備過(guò)程中，加入蛇床子素有望會(huì)促進(jìn)細(xì)胞膜片的形成，提高膜片的成骨效能。本課題旨在探索Osthole對(duì)PDLSCs和頜骨來(lái)源的BMMSCs（Jaw BMMSCs, JBMMSCs）兩種細(xì)胞的膜片形成及其增殖與骨向分化能力的影響，為中藥小分子化合物用于細(xì)胞膜片技術(shù)的改良和加速牙周細(xì)胞治療的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。 目的： 通過(guò)體外Osthole對(duì)人PDLSCs和JBMMSCs的生物學(xué)性能的影響，篩選合適的給藥濃度；探索篩選濃度下，Osthole對(duì)兩種細(xì)胞膜片形成及其成骨效能的影響，為中藥小分子化合物用于細(xì)胞膜片技術(shù)的改良和加速牙周細(xì)胞治療的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。 方法： 1. PDLSCs和JBMMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用改良組織塊法、差異貼壁法分別培養(yǎng)原代牙周膜細(xì)胞和頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞；通過(guò)有限稀釋法分離、純化PDLSCs和JBMMSCs。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)干細(xì)胞表面標(biāo)記物；噻唑藍(lán)(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)比色法、成纖維細(xì)胞集落形成單位（Colony formingunit-firbroblast, CFU-F）檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力；成骨、成脂誘導(dǎo)檢測(cè)細(xì)胞的多向分化功能。 2. Osthole最佳細(xì)胞作用濃度的篩選：設(shè)立Osthole不同濃度組（0Mol/L，10-4Mol/L，10-5Mol/L，10-6Mol/L和10-7Mol/L），通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色和ALP定量試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性的方法，結(jié)合兩種細(xì)胞的作用數(shù)據(jù)，確定Osthole最佳細(xì)胞作用的濃度。 3. Osthole對(duì)兩種細(xì)胞膜片形成和成骨性能的影響：按照篩選的Osthole濃度，進(jìn)一步探索干預(yù)時(shí)間對(duì)兩種細(xì)胞膜片形成和性能的影響。兩種細(xì)胞均設(shè)：無(wú)Osthole干預(yù)組（Control組）、Osthole早期干預(yù)（前3天）組（Osthole1組）、Osthole全程干預(yù)組（Osthole2組）、Osthole后期干預(yù)（后3天）組（Osthole3組），細(xì)胞培養(yǎng)10天后獲取細(xì)胞膜片，通過(guò)蘇木精-伊紅（hemotoxylin and eosin, HE）染色、掃描電鏡（scanning electron microscope, SEM）、蛋白免疫印跡法（Weston-Blot）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞膜片形成能力；同時(shí)，設(shè)置平行對(duì)照組，對(duì)細(xì)胞膜片進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過(guò)ALP染色、茜素紅染色、RT-PCR檢測(cè)其成骨能力，總結(jié)最佳的干預(yù)方法。 4.體內(nèi)異位移植，檢測(cè)兩種細(xì)胞膜片成骨能力：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲取最佳Osthole干預(yù)方法下制備的細(xì)胞膜片，對(duì)兩種細(xì)胞膜片的體內(nèi)異位成骨能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，無(wú)Osthole干預(yù)獲得的細(xì)胞膜片作為對(duì)照。細(xì)胞膜片復(fù)合羥基磷灰石-磷酸三鈣（Hydroxyapatite-tricalcium phosphate, HA-TCP）植入裸鼠皮下，四周后取材，HE染色觀察成骨效果。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）形式表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)p值取雙側(cè)0.05. 結(jié)果： 1.所有標(biāo)本均成功獲得PDLSCs和JBMMSCs，顯微鏡下觀察細(xì)胞均呈梭形，具有自我增殖能力和細(xì)胞克隆能力（PDLSCs16%±0.8%；JBMMSCs8.75%±0.6%），流式細(xì)胞檢測(cè)顯示STRO-1、CD105、CD29、CD90、CD146等間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)陽(yáng)性，CD31、CD45造血干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)陰性。成骨染色可見(jiàn)到鈣化結(jié)節(jié)沉積，成脂染色可見(jiàn)脂滴的形成。 2.經(jīng)不同濃度Osthole干預(yù)培養(yǎng)后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：濃度為10-5Mol/L的Osthole具有最顯著的促進(jìn)兩種細(xì)胞增殖的效果（P0.05）； ALP染色和ALP定量分析結(jié)果也顯示10-5Mol/L為促進(jìn)細(xì)胞骨向分化的最佳給藥濃度。 3. Osthole在不同時(shí)間點(diǎn)加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)10天后HE染色顯示：不同干預(yù)方法獲得的PDLSC膜片，細(xì)胞層數(shù)多為1-2層，而JBMMSC膜片中，細(xì)胞層數(shù)多為2-3層；Weston-Blot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在PDLSCs各組膜片中，F(xiàn)ibronectin蛋白合成和基因表達(dá)與對(duì)照組（無(wú)Osthole干預(yù)組）相比，明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。JBMMSCs形成的膜片中，Osthol1組（早期干預(yù)）與其它組相比，I型膠原（Collagen-I,Col-1）、β1整合素（Integrin-β1）、纖連蛋白（Fibronectin）的蛋白分泌及相關(guān)基因表達(dá)水平明顯增高（P0.05）。 4. Osthole干預(yù)誘導(dǎo)形成的細(xì)胞膜片經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)于JBMMSCs而言，Osthole1中的成骨相關(guān)基因[ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX-2)、骨鈣素（osteocalcin,OCN）]表達(dá)明顯提高（P0.05）；而其余兩組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P0.05）；而對(duì)于PDLSCs而言，Osthole2組（全程干預(yù)）中細(xì)胞的骨向分化趨勢(shì)更為明顯（P0.05）。 5.體內(nèi)移植4周后，PDLSCs/osthole組、JBMMSCs組、JBMMSCs/osthole組形成的細(xì)胞膜片在HA-TCP表面及材料間隙之間均形成了大量的類(lèi)骨質(zhì)樣新生骨，新生骨表面可見(jiàn)成骨樣細(xì)胞及骨陷窩。而PDLSCs組雖然有新生骨的形成，但在材料表面主要以纖維包裹為主。定量分析顯示Osthole干預(yù)組與未干預(yù)組相比，新骨形成量具有非常明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.001）。兩種細(xì)胞間比較，無(wú)Osthole干預(yù)下，JBMMSCs具有更強(qiáng)的成骨能力（P0.05），而經(jīng)過(guò)蛇床子素干預(yù)培養(yǎng)后，兩種細(xì)胞膜片新骨形成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論 1. Osthole給藥濃度對(duì)人PDLSCs和JBMMSCs的生物學(xué)性能產(chǎn)生不同程度的影響，10-5Mol/L濃度更有利于兩種細(xì)胞的增殖和成骨分化。 2. Osthole干預(yù)時(shí)間對(duì)兩種細(xì)胞影響不同：在JBMMSC膜片形成早期、PDLSCs膜片形成全過(guò)程中使用濃度為10-5Mol/L的Osthole進(jìn)行干預(yù)，可以獲得具有良好成骨分化能力的細(xì)胞膜片。 3.無(wú)論是PDLSCs，還是JBMMSCs，Osthole干預(yù)誘導(dǎo)形成的細(xì)胞膜片與未干預(yù)的細(xì)胞膜片相比，在體內(nèi)均具有更強(qiáng)的異位成骨能力。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類(lèi)】：R781.42
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文D90(99.4%)；陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記 CD31(3.2%)和 CD45(2.9%);以上結(jié)果符合質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞特征（圖 2）。

PDLSCs和JBMMSCs表面CD分子表型檢測(cè)

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.3 細(xì)胞自我更新能力鑒定低密度接種 PDLSCs 與 JBMMSCs,常規(guī)培養(yǎng) 14d 后，兩種細(xì)胞均可呈集落樣生長(zhǎng)，具有單克隆形成能力(CFU-F）（圖 3A&B）。其中 PDLSCs 克隆形成率為 16%0.8%，JBMMSCs 克隆形成率為 8.75% ± 0.6%（圖 3C）。MTT 生長(zhǎng)曲線顯示，分離培養(yǎng)的 PDLSCs 和 JBMMSCs 細(xì)胞均在培養(yǎng) 4d 后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，7d 后仍呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)；PDLSCs 自第 4d 起增殖活性明顯高于 JBMMSCs（p<0.05）（圖 3D）。
【參考文獻(xiàn)】

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