牙齒的發(fā)生和發(fā)育是由釉質(zhì)形成所需的牙源性上皮細(xì)胞和形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞共同來完成。因此牙齒的再生必須要有兩種細(xì)胞:上皮和間充質(zhì)細(xì)胞。組織工程化牙齒研究的關(guān)鍵在于:獲取來源豐富且具有成牙潛能的種子細(xì)胞,使其在適宜的成牙微環(huán)境下發(fā)育、分化。由于牙源性種子細(xì)胞的難以獲得,所以尋找合適的的成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞是再生研究的重要目標(biāo)。人牙齦成纖維細(xì)胞是口腔粘膜牙齦組織的主要細(xì)胞,在牙齦、牙周組織的生理和病理中起重要作用。這種細(xì)胞來源豐富,有很強(qiáng)的生長和自我繁殖能力。依據(jù)真皮組織干細(xì)胞的研究進(jìn)展情況來看,由于口腔粘膜與皮膚類似所以提示研究者在口腔粘膜中也應(yīng)該含有類似的成體干細(xì)胞存在。因成體干細(xì)胞具有可塑性,如能從牙齦固有層中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,將非牙源性成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為牙源性細(xì)胞,將為組織工程牙齒的構(gòu)建提供新的種子細(xì)胞來源。本研究采用組織塊和胰酶消化法原代培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和真皮干細(xì)胞,并對牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上利用SD大鼠發(fā)育早期的牙胚條件培養(yǎng)液來誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞向特定方向分化的可能性,探討牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞向牙源性間充質(zhì)細(xì)胞分化的能力。為篩選和誘導(dǎo)組織工程牙齒種子細(xì)胞提供研究參考。取得的主要研究結(jié)果如下: 1.牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性的研究 經(jīng)患者/監(jiān)護(hù)人同意后取臨床上導(dǎo)萌術(shù)或者智齒拔出時切下的牙齦采用組織塊和胰酶消化法進(jìn)行牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)。利用磁珠分選法和有限稀釋法對原代培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行篩選純化,將克隆形成的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長狀況。對篩選細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞表型以及細(xì)胞周期的特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示所培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)多為長梭形,為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。使用流式細(xì)胞儀檢測牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞表型,結(jié)果顯示對于間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物CD29、CD90分別有99.8%和99.4%的表達(dá)陽性。說明了我們獲取的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。與此同時對于CD34和CD45的低表達(dá)也表明我們培養(yǎng)的牙齦纖維來源的間充質(zhì)干細(xì)胞為非造血系來源細(xì)胞。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞具有克隆形成能力,生長狀態(tài)穩(wěn)定,經(jīng)誘導(dǎo)后有成骨和成脂肪能力。流式細(xì)胞周期分析顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞多數(shù)處于G0/G1期。免疫化學(xué)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD105、CD146、STOR-1細(xì)胞均呈陽性表達(dá);增殖細(xì)胞核抗原Ki67,多數(shù)細(xì)胞呈陽性且增殖旺盛。由此看來確定所分離細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.牙齦固有層間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周膜、真皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較. 為進(jìn)一步探討牙齦固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,我們對人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和真皮干細(xì)胞采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。繪制生長曲線,測定三者堿性磷酸酶活性;使用流式細(xì)胞術(shù)檢測三種細(xì)胞的表面分子表達(dá)、細(xì)胞增殖檢測(MTT、細(xì)胞周期分析)、多向分化(成脂、成骨)能力檢測、RT-PCR檢測。觀察對比三種細(xì)胞其形態(tài)、生長方式、增殖能力等生物學(xué)特性的異同。結(jié)果顯示,光鏡下觀察三種細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上相似。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)成功率及細(xì)胞增殖能力明顯高于牙周膜干細(xì)胞但低于真皮干細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)在檢測三種干細(xì)胞的表面分子CD90、CD105表達(dá)中,牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)最高。在PCR檢測中牙周膜干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的I型膠原表達(dá)強(qiáng)于真皮干細(xì)胞,Ⅲ型膠原表達(dá)牙周膜干細(xì)胞最強(qiáng),真皮干細(xì)胞其次,牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)最弱。牙齦間充質(zhì)細(xì)胞的ALP水平明顯高于真皮干細(xì)胞,但低于牙周膜干細(xì)胞。成脂、成骨多向分化能力檢測中牙周膜干細(xì)胞牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞真皮干細(xì)胞。結(jié)論:牙周膜干細(xì)胞具有較強(qiáng)的成骨能力,是理想的牙齒組織工程的種子細(xì)胞。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞成脂成骨能力優(yōu)于真皮干細(xì)胞易于培養(yǎng)成活,增殖力強(qiáng),具有牙周膜干細(xì)胞的一些特點,也可考慮作為牙齒組織工程的種子細(xì)胞。 3.牙胚條件培養(yǎng)基對牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞牙向分化的體外誘導(dǎo)研究 以牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液為輔助誘導(dǎo)液對牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞提供成牙微環(huán)境,誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行牙向分化誘導(dǎo)。結(jié)果表明,牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外一段時間的牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,細(xì)胞增殖能力變強(qiáng);牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后RT-PCR能夠表達(dá)DMP-1、BSP、OPN、ALP。免疫熒光染色顯示牙相關(guān)DMP-1。牙胚細(xì)胞條件液不僅可上調(diào)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性,還可促進(jìn)其細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,形成礦化結(jié)節(jié)。該實驗為尋找非牙源性間充質(zhì)細(xì)胞替代牙源性間充質(zhì)細(xì)胞的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示,牙胚條件培養(yǎng)基能夠促使牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向牙源性間充質(zhì)細(xì)胞方向分化。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

1A、B牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)

2.1A-C有限稀釋法獲得單細(xì)胞來源人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞克隆

2.2D甲苯胺藍(lán)對克隆進(jìn)行染色
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2847358