背景:牙周膜是連接著牙槽骨和牙骨質(zhì)的特殊致密結(jié)締組織。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)通常指牙周膜中以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞群,具有多向分化和自我更新的能力,在牙周組織再生治療和正畸治療中都發(fā)揮著重要作用。初級(jí)纖毛是廣泛存在于多種細(xì)胞表面的保守細(xì)胞器,缺失會(huì)導(dǎo)致一系列“纖毛病”。初級(jí)纖毛的形成和維持需要纖毛運(yùn)輸?shù)鞍?Intraflagella Transport,IFT)不斷的貨物運(yùn)輸。IFT88為FT-B復(fù)合體的核心組分,破壞此蛋白會(huì)導(dǎo)致初級(jí)纖毛形成缺陷。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn),初級(jí)纖毛在感知機(jī)械應(yīng)力,調(diào)節(jié)骨平衡方面發(fā)揮著重要作用。目的:第一部分:構(gòu)建IFT88基因沉默模型抑制hPDLCs初級(jí)纖毛的形成。探討抑制hPDLCs中初級(jí)纖毛形成后對(duì)其增殖和成骨分化能力的影響。第二部分:利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析探討初級(jí)纖毛在hPDLCs感知靜壓力過(guò)程中發(fā)生變化的相關(guān)纖毛基因和調(diào)控機(jī)制。方法:第一部分:組織塊法原代培養(yǎng)和鑒定hPDLCs,取第4-7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建shIFT88慢病毒載體,對(duì)hPDLCs進(jìn)行慢病毒感染,得到IFT88基因沉默表達(dá)的hPDLCs細(xì)胞株(shIFT88組),同時(shí)感染無(wú)意序列作為對(duì)照(NC組)。western blot和定量PCR檢測(cè)IFT88沉默效率,免疫熒光檢測(cè)初級(jí)纖毛的形成率。平板克隆實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖,定量PCR檢測(cè)NC組和shIFT88組成骨相關(guān)因子COLIA1、ALP、Runx2、BMP2表達(dá)量變化。第二部分:模擬正畸壓應(yīng)力構(gòu)建體外靜壓力模型。取第4-7代NC組和shIFT88組細(xì)胞接種于6孔板,NC組和shIFT88組分別設(shè)置不加靜壓力的對(duì)照組和施加2g/cm2靜壓力4h的實(shí)驗(yàn)組。收樣提取RNA,檢測(cè)RNA質(zhì)量合格后送樣進(jìn)行建庫(kù),測(cè)序,篩選出差異基因(differentially expression genes,DEGs)并進(jìn)行分析。結(jié)果:1.免疫熒光顯示:人牙周膜細(xì)胞表面存在初級(jí)纖毛,纖毛率為60.27±1.83%。2.成功構(gòu)建hPDLCs中IFT88基因沉默模型。沉默IFT88基因表達(dá)后,hPDLCs初級(jí)纖毛率明顯降低(P0.01)。3.hPDLCs中初級(jí)纖毛形成抑制后細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P0.01),成骨相關(guān)因子 COL1A1、ALP、Runx2、BMP2 表達(dá)量明顯下調(diào)(P0.01)。4.測(cè)序結(jié)果分析得出,與不加靜壓力的對(duì)照組細(xì)胞相比,施加靜壓力4h后,NC組有840個(gè)差異表達(dá)基因,shIFT88組有498個(gè)差異表達(dá)基因。5.將差異表達(dá)基因與纖毛金標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),NC組發(fā)現(xiàn)8個(gè)上調(diào)纖毛基因和2個(gè)下調(diào)纖毛基因,shIFT88組未發(fā)現(xiàn)相關(guān)纖毛基因。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)TGF-beta signaling pathway 和 osteoclast differentiation 在 NC 組發(fā)生富集,而在shIFT88組未發(fā)生富集。選取部分差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果一致。結(jié)論:人牙周膜細(xì)胞存在初級(jí)纖毛,IFT88基因沉默能有效抑制初級(jí)纖毛的形成。初級(jí)纖毛形成抑制后hPDLCs增殖能力減弱,成骨相關(guān)因子的基礎(chǔ)表達(dá)量明顯下調(diào),說(shuō)明初級(jí)纖毛有可能參與調(diào)控hPDLCs的增殖和成骨向分化。hPDLCs感知靜壓力過(guò)程中NC組多個(gè)纖毛基因發(fā)生變化,TGF-beta signaling pathway和osteoclast differentiation均被激活,抑制初級(jí)纖毛形成后這些纖毛基因和通路的變化均未被檢測(cè)到。初級(jí)纖毛可能通過(guò)這些纖毛基因調(diào)控TGF-beta信號(hào)通路和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化進(jìn)而參與hPDLCs感知靜壓力調(diào)節(jié)骨平衡的生理過(guò)程。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R781
【部分圖文】：

穩(wěn)態(tài)的研宄進(jìn)展做以下綜述。??１．纖毛的基本結(jié)構(gòu)和功能??１．１纖毛的基本結(jié)構(gòu)（圖１）??纖毛的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上非常保守，主要包括軸絲、基體、過(guò)渡區(qū)、纖毛膜和基??質(zhì)幾個(gè)部分ｔｌ９’２°］。纖毛內(nèi)沒(méi)有合成蛋白質(zhì)的體系，這些蛋白質(zhì)在胞質(zhì)中合成，依??靠纖毛內(nèi)運(yùn)輸（ＥＦＴ）系統(tǒng)，沿著軸絲微管運(yùn)輸?shù)嚼w毛中，同時(shí)ＥＦＴ將代謝廢物等??運(yùn)出纖毛，完成纖毛的組裝和維持％?２１］。ＩＦＴ復(fù)合體分為ＩＦＴ－Ａ和ＩＦＴ－Ｂ兩??種復(fù)合體，目前研宄認(rèn)為，ＩＦＴ－Ｂ復(fù)合體可能在與正向分子馬達(dá)結(jié)合的同時(shí)，與??軸絲前體蛋白相結(jié)合，將其運(yùn)入纖毛，而ＥＦＴ－Ａ復(fù)合體與反向分子馬達(dá)結(jié)合，??將纖毛內(nèi)的蛋白運(yùn)出纖毛［２２］。??１．２纖毛的基本功能??根據(jù)有無(wú)中央微管，我們可將纖毛分為“９＋２”型的動(dòng)纖毛和”９＋０”型的原??纖毛

２．?３．１?ｐＬＫＯ．?１?載體??ｐＬＫＯ．?１為ＴＲＣ?（ｔｈｅ?ＲＮＡｉ?Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）組織建立的復(fù)制缺陷型慢病毒載體，??能夠持續(xù)表達(dá)ｓｈＲＮＡ，載體圖譜如圖２所示。??ｓｈＲＮＡ??Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ??Ｕ６?ｃＰＰＴ??〇?ｐＬＫＯ．１?ｐｕｒｏ?ｆｔｓｉｎ３＇ＬＴＲ??５?ＬＴＲＵ?ｗｉｔｈ?ｓｈＲＮＡ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ?＇??７．０９１?ｂｐ??ｐＵＣ??Ａｍｐ?Ｒ??圖２：ｐＬＫＯ．?１載體圖譜??２．３．２?ｓｈＲＮＡ載體構(gòu)建??向ＴＲＣ公司提交ＩＦＴ８８基因序列得到一系列備選序列，篩選得分較高的序??列添加到〇ｌｉｇ〇中，〇ｌｉｇ〇引物列表如表１所不??１２??

搜樂(lè)苣は赴?鮒澈統(tǒng)曬竅蚍只?案兄?慚沽Φ撓跋歟崳?１?ｈＰＤＬＣｓ存在初級(jí)纖毛??如圖３所示，ｈＰＤＬＣｓ存在初級(jí)纖毛（乙�；簦酰猓酰欤椋顦�(biāo)記初級(jí)纖毛），共統(tǒng)??計(jì)５個(gè)樣本，每個(gè)樣本于２０倍鏡頭下隨機(jī)選取５個(gè)視野，依次統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)和初??級(jí)纖毛個(gè)數(shù)，得出纖毛率。纖毛率為６０．２７±１．８３％。??圖３：免疫熒光顯示初級(jí)纖毛：乙�；簦酰猓酰欤椋睿ňG色熒光）和ＤＡＰＩ?（藍(lán)色熒光）的??定位，白色箭頭指示部分初級(jí)纖毛。（Ｂａｒ＝２５ｕｍ）??２檢測(cè)慢病毒感染后ｈＰＤＬＣｓ中ＩＦＴ８８表達(dá)的變化。??實(shí)驗(yàn)分為兩組：ＮＣ組為感染無(wú)意序列組ｈＰＤＬＣｓ，?ｓｈ［ＦＴ８８組為感染帶有??ｓｈＩＦＴ８８序列的慢病毒的ｈＰＤＬＣｓ。ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果（圖４Ａ）顯示：與ＮＣ組相??比，ｓｈＩＦＴ８８組丨ＦＴ８８基因表達(dá)水平下調(diào)至０．?０２?（；？〈０．?０１）；?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ結(jié)果顯示??（圖４Ｂ）ｓｈＩＦＴ８８組幾乎檢測(cè)不到丨ＦＴ８８，表達(dá)量明顯低于ＮＣ組。說(shuō)明慢病毒感??染后ＩＦＴ８８基因沉默效果明顯。??Ａ?Ｂ??１．２?ｒ??－??４＜ｊ￡?ｚ?Ｈ??麵義〇．４?．?■麵邏嚇�。福�??７５??＊＊?５０?ｐ－ｔｕｂｕｌｉｎ??０．０１————??ＮＣ?ｓｈＩＦＴ８８??圖４：慢病毒感染ｈＰＤＬＣｓ后丨ＦＴ８８表達(dá)水平（Ａ）?ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)丨ＦＴ８８表達(dá)情況，??＊＊ｐ＜０．?０１；?（Ｂ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?檢測(cè)?ＩＦＴ８８?表達(dá)情況。??２１??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2838370