背景與目的： 腭裂是一種常見出生缺陷,其發(fā)生有遺傳因素,也有環(huán)境因素。遺傳因素僅占10%-25%,多數(shù)是由環(huán)境-遺傳相互作用而誘發(fā)的。在腭器官發(fā)育過程中,間充質(zhì)細胞軟骨分化異常及增殖異常是導致腭裂發(fā)生的重要因素之一。全反式視黃酸(all-trans Retinoic acid, atRA)是維生素A(Vitamin A, VitA)的氧化代謝產(chǎn)物,也是VitA的生理活性形式。動物實驗和人群流行病學調(diào)查結(jié)果顯示,VitA缺乏或過量均可誘發(fā)腭裂。TGFβ是一組細胞因子,對于哺乳動物腭器官發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用,其基因缺陷型仔鼠全部存在腭裂。atRA可影響多種組織細胞分泌TGFβ,在胚胎間充質(zhì)組織分化過程中,高劑量atRA可引起內(nèi)源性TGFβ1以及TGFβ受體Ⅱ表達水平降低,并抑制長骨發(fā)育中的軟骨形成。哺乳動物上腭是骨性器官,atRA是否能夠通過TGFβ/Smads信號而影響腭器官發(fā)育中的軟骨形成,目前尚不清楚。本次研究通過觀察藥理劑量的atRA對腭間充質(zhì)細胞軟骨分化的影響,及其對TGFβ/Smads信號途徑的調(diào)節(jié)作用,探討atRA誘發(fā)腭裂的作用機制,為腭裂預防提供理論指導。 方法： 本研究分為體內(nèi)實驗和體外實驗兩部分。體內(nèi)實驗分兩組,每組6只孕鼠,在小鼠孕11天(GD11),實驗組連續(xù)3天給予atRA灌胃(80mg/kg·d-1),對照組以同樣的方法給予等量的食用油。在GD18處死孕鼠,取出胎鼠,觀察atRA的胚胎發(fā)育毒性,及其對腭器官發(fā)育的影響。體外實驗采用細胞培養(yǎng)的方法,對GD12胎鼠腭間充質(zhì)細胞進行高密度微團培養(yǎng),在軟骨分化過程中,觀察atRA對軟骨分化的影響,及其對TGFβ1和Smads表達激活的影響。用阿爾新藍定量染色法檢測糖胺聚糖含量,以分析腭間充質(zhì)細胞的軟骨分化情況；用western blot檢測TGFβ1和Smads蛋白表達及磷酸化水平。采用SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,多樣本均數(shù)比較采用方差分析,各實驗組與對照組的比較用Dunnet-t檢驗,分類變量資料采用χ2檢驗,檢驗水準α=0.05。 結(jié)果： 動物實驗結(jié)果顯示,atRA組仔鼠畸形發(fā)生率46.4%,對照組為5.8%,兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=28.990, P0.05); atRA組致死胎鼠率為7.2%,對照組為0%,兩者差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); atRA組仔鼠腭裂發(fā)生率59.5%,對照組為1.5%,兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.374,P0.05)。胎鼠腭間充質(zhì)細胞軟骨分化實驗結(jié)果顯示,在0.1-5.0gM濃度范圍內(nèi),atRA呈劑量-效應關系抑制軟骨分化。western blot檢測表明,atRA抑制TGFβ1蛋白表達和Smad2/3磷酸化水平,并誘導提高Smad7的表達水平。 結(jié)論： (1)在小鼠胚胎發(fā)育過程中,過量atRA具有胚胎發(fā)育毒性,可誘發(fā)腭裂在內(nèi)的多種畸形。 (2) atRA通過影響TGFβ/Smads信號途徑,并抑制腭間充質(zhì)細胞軟骨分化,這可能是atRA誘發(fā)腭裂的作用機制之一。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R782.2
【部分圖文】：

胎鼠大體發(fā)育狀況觀察結(jié)果顯示，從GDn用som叭g’d一‘a(chǎn)tRA連續(xù)灌胃三天的胎鼠，多數(shù)體型明顯較小，頭部有膨出，眼耳鼻發(fā)育不完全，四肢短小且不能正常伸展，周身的血管發(fā)育不完善(如圖3.1右所示)，而對照組胎鼠四肢完整，血管豐富，耳鼻眼和嘴均發(fā)育正常(如圖3.1左所示)。

3.2過量atRA胎鼠鱷發(fā)育的影響對愕發(fā)育狀況的觀察結(jié)果顯示，對照組上愕發(fā)育完全融，實驗組上愕沒有完全融合(如圖3.2所示);實驗組仔鼠有18例發(fā)生愕裂，對照組仔鼠僅有1例愕裂發(fā)生;實驗組仔鼠愕裂發(fā)生率為59.5%，對照組仔鼠愕裂發(fā)生率為1.5%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(了一17.374，尸動.05)(如表3.2所示)。表 3.2過量魷RA對胎鼠上愕發(fā)育的影響實驗分組屬性食用油對照組80m眺g.d一，atRA合計了組愕裂數(shù)17.374 <0.001未愕裂數(shù)合計

圖3.2對照組胎鼠愕(A)與80mg/kg.d一，以RA處理組胎鼠愕(B)atRA對胎鼠軟骨分化的影響圖3.3是由阿爾新藍定量染色而得到的結(jié)果，縱坐標是阿爾新藍定量染出的吸光度(其與糖胺聚糖表達量成正比)，橫坐標表示處理方式。與對相比，在0.1林M和0.5卿濃度條件下，atRA對糖胺聚糖的表達量沒有明制作用(尸均>0.05);在1林M及5林M濃度條件下，以RA對糖胺聚糖表抑制的作用有統(tǒng)計學意義(尸均<0.001)，說明atRA對愕間充質(zhì)細胞軟化的抑制作用存在劑量一效應關系。
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本文編號：2838193