實驗背景顳下頜骨關(guān)節(jié)炎是影響整個關(guān)節(jié)的復(fù)雜病癥,通過檢查可發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)骨、軟骨和關(guān)節(jié)盤均有退行性改變,并且最終結(jié)局之一為關(guān)節(jié)軟骨的喪失。白細(xì)胞介素-1β是顳下頜骨關(guān)節(jié)炎中最重要的細(xì)胞因子之一,可通過上調(diào)幾種炎癥介質(zhì)和蛋白水解酶的表達(dá),如MMP-3、MMP-9、MMP-13,因此,阻斷IL-1β或IL-1β誘導(dǎo)的炎癥可能有效地減輕OA的進(jìn)展。有研究證明,CO能夠抑制細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)等,一氧化碳釋放分子3能夠在生理環(huán)境下可控地釋放CO,模擬生理條件下CO的作用。盡管一氧化碳釋放分子3在抗炎方面研究廣泛,但是其能否對IL-1β引起的軟骨破壞起到保護(hù)作用,目前還不十分清楚。目的探究一氧化碳釋放分子3對白介素-1β誘導(dǎo)的髁突軟骨細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的調(diào)控作用及其作用機制。材料與方法采用3-4周齡的雄性Wistar大鼠體外培養(yǎng)制備髁突軟骨細(xì)胞,應(yīng)用顯微鏡觀察其體外培養(yǎng)情況,并用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法和甲苯胺藍(lán)染色法,以鑒定分離、培養(yǎng)的細(xì)胞為髁突軟骨細(xì)胞。通過細(xì)胞增殖實驗測定不同濃度(0、100、200、400、800μM)CORM-3對髁突軟骨細(xì)胞的毒性作用。運用實時定量PCR檢測0、5、10、20ng/ml的IL-1β刺激24h后各組細(xì)胞中MMP-3、9、13的mRNA表達(dá)量。根據(jù)結(jié)果選用1Ong/ml作為IL-1β的后續(xù)實驗濃度。用qRT-PCR、Western Blot法檢測200μM CORM-3對IL-1β誘導(dǎo)的髁突軟骨細(xì)胞MMP-3、9、13 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。運用Western Blot法檢測10ng/ml IL-1β3刺激細(xì)胞5min、10min、30min后細(xì)胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的蛋白表達(dá)量,根據(jù)結(jié)果選用1Omin作為后續(xù)實驗MAPK通路激活的時間。用Western Blot法檢測CORM-3、SP600125、SB203580、U0126對IL-1β誘導(dǎo)的髁突軟骨細(xì)胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的蛋白表達(dá)量及MMP-3、9、13的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量的作用。結(jié)果(1)原代培養(yǎng)的大鼠髁突軟骨細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞不均勻分布,呈多角形,類圓形細(xì)胞較少,形態(tài)欠規(guī)則;細(xì)胞生長至第8天左右,出現(xiàn)“鋪路石樣”特征;甲苯胺藍(lán)染色,培養(yǎng)細(xì)胞呈異染性,證明培養(yǎng)的細(xì)胞為髁突軟骨細(xì)胞;(2)細(xì)胞增殖實驗表明200μM的CORM-3對髁突軟骨細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性;(3)10ng/ml IL-1β可顯著增強大鼠髁突軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá);(4)200μM的CORM-3可顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠髁突軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 的表達(dá)。(5)1Ong/ml IL-1β在1Omin時顯著激活MAPKs信號通路。(6)2000μM CORM-3可顯著抑制P38、ERK信號通路的激活。結(jié)論CORM-3通過抑制P38、ERK信號通路來顯著下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的髁突軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13的表達(dá),為顳下頜骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R782.6
【部分圖文】：

逡逑圖１－１．大鼠髁突軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)Ａ．原代培養(yǎng)大鼠髁突軟骨細(xì)胞；Ｂ．細(xì)胞形態(tài)多呈多逡逑邊形；Ｃ．細(xì)胞出現(xiàn)“鋪路石樣”改變。逡逑２．髁突軟骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色的鑒定逡逑第二代軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，可見單層細(xì)胞生長區(qū)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞逡逑外基質(zhì)呈紫蘭色，細(xì)胞核大而圓，呈深藍(lán)色，細(xì)胞呈多邊形，據(jù)此鑒定分離的細(xì)逡逑胞為軟骨細(xì)胞（圖１－２）。逡逑－逡逑圖１－２．經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色鑒定的軟骨細(xì)胞（ｘｉｏｏ），細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及逡逑細(xì)胞外基質(zhì)呈紫蘭色。逡逑討論逡逑關(guān)節(jié)軟骨是一種不同尋常的組織，缺乏自我修復(fù)能力，軟骨細(xì)胞含量較少，逡逑細(xì)胞外基質(zhì)較多，其基質(zhì)的特性主導(dǎo)其功能和生物學(xué)特性［３Ｇ］。本實驗采用序貫逡逑酶消法獲得了純度較高的大鼠髁突軟骨細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于軟骨細(xì)逡逑胞在體內(nèi)和體外環(huán)境的差異，細(xì)胞表型并不能長久地保持一致，在３代以前生長逡逑良好

第二代軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，可見單層細(xì)胞生長區(qū)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞逡逑外基質(zhì)呈紫蘭色，細(xì)胞核大而圓，呈深藍(lán)色，細(xì)胞呈多邊形，據(jù)此鑒定分離的細(xì)逡逑胞為軟骨細(xì)胞（圖１－２）。逡逑－逡逑圖１－２．經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色鑒定的軟骨細(xì)胞（ｘｉｏｏ），細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及逡逑細(xì)胞外基質(zhì)呈紫蘭色。逡逑討論逡逑關(guān)節(jié)軟骨是一種不同尋常的組織，缺乏自我修復(fù)能力，軟骨細(xì)胞含量較少，逡逑細(xì)胞外基質(zhì)較多，其基質(zhì)的特性主導(dǎo)其功能和生物學(xué)特性［３Ｇ］。本實驗采用序貫逡逑酶消法獲得了純度較高的大鼠髁突軟骨細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于軟骨細(xì)逡逑胞在體內(nèi)和體外環(huán)境的差異，細(xì)胞表型并不能長久地保持一致，在３代以前生長逡逑良好，在３代以后出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)由多角形逐漸變?yōu)殚L梭形，細(xì)胞的逡逑這種特質(zhì)提示我們在三代以內(nèi)的細(xì)胞可能是適合作為實驗研宄的細(xì)胞，為進(jìn)一步逡逑研究大鼠髁突軟骨細(xì)胞的其他的生物學(xué)特性和顳下頜骨

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文計學(xué)意義。逡逑結(jié)果逡逑鼠髁突軟骨細(xì)胞的毒性作用逡逑，ＣＯＲＭ－３濃度在１００？４００＾Ｍ之間對髁突軟骨＾ｉＭＣＯＲＭ－３有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，吸光度（Ｐ＜0．0５）。ＣＯＲＭ－３濃度在４０0ｈＭ時大鼠髁８００ｆｉＭ邋ＣＯＲＭ－３組可抑制大鼠髁突軟骨細(xì)胞的００ｐＭＣＯＲＭ－３作為實驗濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。逡逑０．８－．逡逑

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本文編號：2832533