齲齒在大多數(shù)國(guó)家是主要的口腔問(wèn)題。根據(jù)第三次全國(guó)口腔健康調(diào)查的結(jié)果,我國(guó)5歲兒童乳牙齲病的患病率為66.0%,12歲兒童恒牙齲病的患病率為28.9%,35-44歲中年人齲病患病率為88.1%，65-74歲老年人齲病患病率為98.4%(全國(guó)牙病防治指導(dǎo)組,2008)。雖然包括食品加氟等預(yù)防齲齒的有效方式己在臨床中被應(yīng)用(Hinman, Sterritt et al.1996; Ellwood, Blinkhorn et al.1998),但是對(duì)于如何對(duì)抗引起感染的的病原體微生物卻缺少合適的治療方法(Gu, Lux et al.2002; Luoma, Murtomaa et al.2009)。這是因?yàn)榭谇皇且粋�(gè)擁有豐富多樣微生物群落的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),對(duì)它采取任何干擾措施,都會(huì)造成一系列無(wú)法預(yù)期的連鎖反應(yīng)(Brook1999).因此為了消除口腔病原菌而提出的細(xì)菌替代療法成為研究的新思路。 變異鏈球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)被認(rèn)為是與人類口腔齲齒最密切相關(guān)的主要病原體。其在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì),因造成牙面的礦物質(zhì)溶解,成為其主要致齲毒力因子(Loesche1986)。此外,變異鏈球菌對(duì)牙面的蔗糖依賴性黏附能力幫助細(xì)菌不會(huì)在咀嚼黏附或唾液沖刷的的過(guò)程中被沖洗掉。本次實(shí)驗(yàn)中,我們嘗試加強(qiáng)低產(chǎn)酸效應(yīng)菌株的蔗糖黏附能力以增強(qiáng)其與更具致齲性的親代菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)力,理論上這將最終導(dǎo)致效應(yīng)菌株在同一個(gè)小生境中搶先占據(jù)相應(yīng)的位點(diǎn)(Hillman, Brooks et al.2000)。 在本研究中,我們構(gòu)建出gcrR缺陷的變異鏈球菌效應(yīng)株MS-gcrR-def并與野生型UA159比較其形態(tài)變化,黏附和產(chǎn)酸能力的差異。根據(jù)一系列體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物致齲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,說(shuō)明缺失了整個(gè)gcrR基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)的變異株MS-gcrR-def展示出較低的產(chǎn)酸和較強(qiáng)的定植能力,以及較低的致齲能力。 本研究分以下三個(gè)部分進(jìn)行： 第一部分變異鏈球菌gcrR缺陷株MS-gcrR-def的構(gòu)建 首先根據(jù)Genebank中S. mutans的gcrR基因序列及其上下游同源基因,用Primer5.0設(shè)計(jì)克隆引物gcrR-For和gcrR-Rev,將其PCR產(chǎn)物插入質(zhì)粒pMD18-T,形成新的重組質(zhì)粒pMD-G。根據(jù)重組質(zhì)粒pMD-G的序列在保留gcrR基因翻譯起始密碼子上游720bp和終止密碼子下游705bp同源區(qū)的基礎(chǔ)上,利用反向PCR方法,為了完全去除gcrR的開(kāi)放閱讀框架,設(shè)計(jì)反向PCR引物gcrR-rp-For和gcrR-rp-Rev。為了在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保證與卡那霉素抗性基因的定向連接,在下游引物gcrR-rp-For和上游引物gcrR-rp-Rev的5’端分別加入Clal和Xhol酶切位點(diǎn)。此外以質(zhì)粒pEGFP-N1為模板,設(shè)計(jì)克隆引物KanR-For和KanR-Rev,獲得卡那抗性片段(KanR,795bp),為了便于在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中插入,在上下游引物的5’端插入Clal和Xhol。將反向PCR獲得的包含質(zhì)粒pMD18-T和gcrR上下游的線性片段及通過(guò)PCR獲得的卡那霉素抗性片段,經(jīng)Clal和Xho1酶切后實(shí)用T4連接酶連接得到重組質(zhì)粒命名為pMD-GK(4915bp)。以上引物序列送至上海生工合成。為獲得相應(yīng)的PCR產(chǎn)物,在含有Ex Taq DNA聚合酶和Buffer的50μ1混合物中加入相應(yīng)引物,并放置入PCR儀(ABI),運(yùn)行以下程序：95℃預(yù)變性3min,然后30個(gè)循環(huán)的95℃變性30s并在合適的溫度下退火30s,72℃延伸30s,循環(huán)結(jié)束后72℃延伸3min。 為確認(rèn)所構(gòu)建的質(zhì)粒pMD-GK序列正確,以其為模板,用gcrR-For和gcrR-Rev進(jìn)行PCR后做1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,見(jiàn)約2.1kb處有一特異條帶。以Cla I和Xho I酶切重組質(zhì)粒pMD-GK后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,放出長(zhǎng)約795的卡那抗性片段。以BamHI和Sal I酶切重組質(zhì)粒后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,放出長(zhǎng)2.2kb的片段。將其送至上海生工測(cè)序,得到gcrR上下游片段和卡那抗性片段都是正確的。由于pMD18是在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒,在鏈球菌中通常不能復(fù)制,并且同時(shí)擁有抗性基因的標(biāo)記,是-種較為方便取得的自殺載體,可用于同源重組(Ortiz-Martin, Macho et al.2006)。同源重組是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞染色體上的方法,因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)入基因同源的序列,通過(guò)單一或雙交換,新基因片段可替換有缺陷的基因片段,達(dá)到修改基因的目的(Burr, Burr et al.1988). 由于變異鏈球菌是轉(zhuǎn)化率很低的革蘭氏陽(yáng)性菌,本身的轉(zhuǎn)化效率很低且菌株間轉(zhuǎn)化能力有較大的差異(邊專and樊明文1996),所以本實(shí)驗(yàn)用感受態(tài)刺激肽(Competence stimulating peptide, CSP)誘導(dǎo)變異鏈球菌UA159,使之較容易攝取外源性DNA,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室先前的研究(Lau, Sung et al.2002),其轉(zhuǎn)化效率提高了20倍以上。加入感受態(tài)刺激肽,如文獻(xiàn)所描述的方法將質(zhì)粒pMD-GK轉(zhuǎn)化入變鏈UA159,并涂于含1mg/ml卡那霉素的TH平板上(Li, Lau et al.2001)。37℃厭氧過(guò)夜培養(yǎng)并從中選擇轉(zhuǎn)化株。載體pMD-GK進(jìn)入細(xì)菌內(nèi),獲得了隨機(jī)插入變異鏈球菌基因組的機(jī)會(huì)。同時(shí)由于位于卡那抗性片段兩側(cè)的gcrR上下游同源臂的存在,可與染色體上的互補(bǔ)序列結(jié)合,并在復(fù)制過(guò)程中誘導(dǎo)發(fā)生染色體上的gcrR基因與質(zhì)粒上的卡那抗性基因互換。由于抗性基因的標(biāo)記,最終能在含卡那霉素的瓊脂平板上生長(zhǎng)的即為成功發(fā)生同源重組的轉(zhuǎn)化株。通過(guò)微量反應(yīng)糖管和菌落形態(tài)的的觀察,可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子是變異鏈球菌。提取變異株的染色體DNA并將其作為模板,加入引物P1/P2和RT-gcrRF/RT-gcrRR。擴(kuò)增應(yīng)獲得包含gcrR上游及KanR內(nèi)部的拼接片段并應(yīng)同時(shí)缺失gcrR基因片段,通過(guò)凝膠電泳觀察并回收前者用以測(cè)序。根據(jù)電泳和測(cè)序的結(jié)果證實(shí)變異株成功敲除了gcrR基因并插入卡那霉素抗性片段。此變異株被命名為MS-gcrR-def。 第二部分MS-gcrR-def生化特性和形態(tài)方面的研究 對(duì)比變異鏈球菌UA159和gcrR缺陷株MS-gcrR-def的黏附,產(chǎn)酸和致齲能力的改變,探討MS-gcrR-def是否適合作為齲病替代治療的效應(yīng)菌株。為了證明其gcrR缺陷對(duì)變異鏈球菌黏附相關(guān)基因的影響,在相同的含2%蔗糖的BHI培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)變異鏈球菌UA159和變異株MS-gcrR-def。8000g離心后收集菌體,分別提取其總RNA,加入終濃度為10μg/ml的溶菌酶和20μ g/ml的變?nèi)芫?7℃孵育1h。然后加入Trzol混勻并加入異丙醇沉淀。用70%乙醇清洗沉淀RNA,用無(wú)核酸酶水溶解保存。取5μ1RNA溶液加入適量DuRed,2%凝膠電泳觀察RNA是否完整并測(cè)量其濃度。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方法獲得其cDNA,簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),提取變鏈UA159和變異株MS-gcrR-def的總RNA,并按照說(shuō)明書使用cDNA第一鏈合成試劑盒(TaKaRa)獲得cDNA。Real time PCR,即熒光定量PCR技術(shù),逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,與相應(yīng)引物一起加入SYBR green預(yù)混試劑系統(tǒng)(TaKaRa)。放入7500熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI)進(jìn)行擴(kuò)增。其循環(huán)條件如下：95-C預(yù)變性2min,循環(huán)40次95℃5s,60℃60s。為了量化gtfD和gbpC基因,以DNA回旋酶亞基A (gyrA)為內(nèi)參,以確保參與比較的DNA量是一致的。檢測(cè)出參與表達(dá)的gbpC(葡聚糖結(jié)合蛋白C)基因與gtfD(葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶D)基因的結(jié)果說(shuō)明在變異株MS-gcrR-def中g(shù)tfD相對(duì)于野生型或補(bǔ)償株表達(dá)增加(MS-gcrR-def平均RQ=3.8497,UA159平均RQ=0.719,補(bǔ)償株MS-gcrR-def-com平均RQ=1.4487)。同時(shí)gbpC的表達(dá)在變異株中也大幅增加(MS-gcrR-def平均RQ=19.9497for, UA159平均RQ=0.8317, MS-gcrR-def-com平均RQ=1.0913)。其中變異株gtfD的表達(dá)量是野生株的5倍,gbpC的表達(dá)量則高達(dá)是24倍。 對(duì)于體外黏附試驗(yàn),在24孔板中,加入含2%蔗糖的BHI培養(yǎng)基后,1：20接種過(guò)夜培養(yǎng)并調(diào)整為相同OD值(0D470=1.0)的變鏈UA159,變異株MS-gcrR-def和補(bǔ)償株MS-gcrR-def-com菌液,分別培養(yǎng)2h,4h,6h,一式三份,37℃厭氧培養(yǎng)。在指定時(shí)間用酶標(biāo)儀測(cè)試其在470nm處的吸光度。去掉浮游細(xì)菌和培養(yǎng)基,用蒸餾水清洗三次,室溫或溫箱干燥后用0.1%結(jié)晶紫染色15min。然后再用蒸餾水清洗三次,室溫或溫箱干燥后,加入30%乙酸溶液,將生物膜上的結(jié)晶紫漂洗釋放,測(cè)定其在562nm處的吸光度。結(jié)果表明變異株的黏附能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于野生株,尤其是在早期,這一差異的更顯著。 野生型和變異株菌液經(jīng)革蘭氏染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在含2%蔗糖的BHI培養(yǎng)基中,變異株表現(xiàn)出更多的細(xì)菌間的黏附和聚集成團(tuán)的現(xiàn)象,該結(jié)果在早期定植中顯得尤其重要。 將培養(yǎng)了2h,4h,6h,12h,24h的生物膜樣本先用PBS漂洗清除游離細(xì)菌,用分子探針SYT09和碘化丙啶染色5min。染色樣本在共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM510META)下觀察其紅綠熒光并用軟件Image pro-plus6.0分析。圖像表明,變異株能在成膜早期(2h-4h)搶先在Si02上定植并形成生物膜。 將變異株與野生型同時(shí)1：20接種到含4mlBHI培養(yǎng)基的六孔板中,37℃厭氧培養(yǎng)4h,6h,8h,11h’和24h。用蒸餾水清洗除去游離細(xì)菌后,收集附著細(xì)菌,提取其總DNA。通過(guò)熒光定量技術(shù),分析其中變異株所占比例,結(jié)果表明,在同時(shí)培養(yǎng)的混合生物膜內(nèi)變異株達(dá)到90%以上。結(jié)果說(shuō)明,在變異株與野生型UA159同時(shí)存在的時(shí)候,變異株能搶先定植固體表面,并生物膜中限制野生株的生長(zhǎng)。 為了進(jìn)一步探討變異株能否作為合適的替代療法效應(yīng)菌,我們同時(shí)檢測(cè)了其產(chǎn)酸能力。在體外產(chǎn)酸試驗(yàn)中,MS-gcrR-def, MS-gcrR-def-com和野生型UA159以1：100的比例接種到含2%蔗糖的BHI培養(yǎng)基中,并在培養(yǎng)前測(cè)量其pH值(7.3)。經(jīng)過(guò)16h的培養(yǎng),pH值再次被分別測(cè)量。變異株的終末pH為4.11-4.13,其△pH為3.17-3.19,小于野生型和補(bǔ)償株的的△pH3.23-3.25,且此差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外在生長(zhǎng)曲線的觀察中我們發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)穩(wěn)定期,變異株的總量少于UA159,說(shuō)明培養(yǎng)基中累積的酸性物質(zhì),對(duì)變異株的抑制更為明顯。以上結(jié)果表明,MS-gcrR-def的黏附性與UA159相比顯著增強(qiáng),產(chǎn)酸能力減少。 第三部分MS-gcrR-def在SD大鼠中的致齲能力 在喂食三天抗生素后,12只大鼠分為兩組。用棉拭子在牙面上接種濃度為2X109CFU/ml的UA159和MS-gcrR-def的菌液。連續(xù)三天,都用新鮮菌液接種。接種后,用棉拭子收集牙面的細(xì)菌并在MSB板上培養(yǎng),以確認(rèn)定植成功。繼續(xù)向MS-gcrR-def組的大鼠提供含1%菌液的蒸餾水,并一直用致齲飼料2000##喂養(yǎng)。接種過(guò)后40天,處死大鼠并取出上下頜骨行齲齒記分。結(jié)果顯示MS-gcrR-def的致齲能力較野生株降低。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R781.1
【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點(diǎn)
中文摘要
ABSTRACT
引言
綜述 替代療法在齲病中的應(yīng)用
第一部分 變異鏈球菌gcrR缺陷株MS-gcrR-def的構(gòu)建
    實(shí)驗(yàn)一 用于敲除gcrR的載體pMD-GK的構(gòu)建與鑒定
    實(shí)驗(yàn)二 變異鏈球菌gcrR缺陷株MS-gcrR-def的構(gòu)建
第二部分 MS-gcrR-def生化特性和形態(tài)特點(diǎn)的研究
    實(shí)驗(yàn)三 MS-gcrR-def和變異鏈球菌野生株中g(shù)bpC和gtfD表達(dá)情況分析
    實(shí)驗(yàn)四 MS-gcrR-def和野生株的附著實(shí)驗(yàn)
    實(shí)驗(yàn)五 MS-gcrR-def和野生株的競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
    實(shí)驗(yàn)六 MS-gcrR-def與野生株與補(bǔ)償株MS-gcrR-ded-com產(chǎn)酸能力的比較
    實(shí)驗(yàn)七 MS-gcrR-def與野生株生長(zhǎng)曲線的比較
    實(shí)驗(yàn)八 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌相互間的黏附
    實(shí)驗(yàn)九 MS-gcrR-def與野生株的生物膜結(jié)構(gòu)差異
第三部分 MS-gcrR-def在SD大鼠中的致齲能力
    實(shí)驗(yàn)十 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析變異株MS-gcrR-def的致齲能力
結(jié)論
中外參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2831261