發(fā)布時間：2020-09-30 17:15

　　 背景先天性缺牙是人類常見的牙齒發(fā)育異常性疾病之一,其發(fā)病率約為1.6～20%,多發(fā)生于第三磨牙,其次為第二前磨牙和側(cè)切牙。按是否伴發(fā)系統(tǒng)性疾病,可分為綜合征和非綜合征兩種類型。臨床上較為常見的為個別牙缺失(小于6顆),稱為牙齒發(fā)育不全(hypodontia,OMIM 106600,以下均不包括第三磨牙)。當缺牙數(shù)目大于6顆時,稱為少牙畸形(oligodontia,OMIM 604625),它在白種人中的發(fā)病率約為1.1%,可以單獨發(fā)病,也可以和其他系統(tǒng)性疾病伴發(fā)。全口無牙較為少見,它通常是綜合征的臨床表現(xiàn)之一。目前的研究表明,有家族史的少牙畸形呈單基因病的特點,可表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳。該病有兩個較為明確的致病基因,分別是定位于染色體4p16.1～16.3的MSX1 (msh homeobox 1)基因和定位于染色體14q12～13的PAX9(paired box 9)基因,它們均編碼轉(zhuǎn)錄因子,在牙齒發(fā)育過程中起調(diào)控作用。1996年,Vastardis等首先發(fā)現(xiàn)MSX1基因突變造成了人類牙齒的選擇性缺失;2000年,Stockton等報道了第一個PAX9基因突變與大量磨牙先天性缺失相關(guān)。迄今為止,與先天性缺牙相關(guān)的MSX1和PAX9基因突變已經(jīng)達20多個(http://www.hgmd.org/)�；蛐�-表型相關(guān)性分析表明, MSX1基因突變家系的臨床表現(xiàn)包括非綜合征型和綜合征型,唇腭裂為常常合并出現(xiàn)的畸形,累及的牙齒以第二前磨牙和第三磨牙為主;PAX9基因突變的家系主要表現(xiàn)為非綜合征型,以磨牙缺失較為常見。隨著分子生物學實驗技術(shù)的不斷進步,對人類遺傳性疾病的研究更加深入。目前,在先天性缺牙的遺傳學研究領(lǐng)域,多數(shù)是基于家系以進行候選基因的突變篩選研究,其數(shù)據(jù)大多來自歐美,突變多集中于MSX1和PAX9基因。先天性缺牙在中國人中的發(fā)病率較高,但是相關(guān)的遺傳學研究進展較少,因此收集更多的家系篩選基因突變,并進行基因型-表型分析,對于提高中國人先天性缺牙的認識具有非常重要的意義。 目的分析一個中國漢族非綜合征型少牙畸形家系的臨床及遺傳特征,并檢測基因突變情況,為正確理解先天性缺牙的遺傳學發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。 方法收集先天性缺牙家系,設(shè)計調(diào)查表,調(diào)查家系家族史等資料;對家系成員進行全身檢查和口腔�？茩z查,拍攝曲面斷層片;分析家系的臨床資料,總結(jié)其臨床特征;同時整理家族史等資料,繪制系譜圖,做遺傳特征分析;在知情同意的前提下,抽取先證者和部分家系成員的外周血標本,提取全血基因組DNA;針對PAX9和MSX1基因設(shè)計特異性的引物,采用聚合酶鏈式反應(PCR)結(jié)合DNA直接雙向測序的方法,檢測了該家系中7例患者及7例表型正常者和100例無親緣關(guān)系健康個體的基因突變;查閱CBM和Pubmed比對信息,排除多態(tài)性,以確認突變;應用生物信息學預測突變對功能的影響。 結(jié)果該家系表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,且該病在家系中外顯率較高。家系患者的臨床特征為非綜合征型多數(shù)牙缺失、牙齒形態(tài)發(fā)育異常和牙齒異位、間隙及牙合關(guān)系異常,牙齒缺失以第二前磨牙和第三磨牙為主。基因檢測結(jié)果顯示,MSX1基因的內(nèi)含子1的3’上游2bp處存在一個新的替代突變IVS1-2AG (451AG),使內(nèi)含子1的剪切受體位點發(fā)生改變。該突變未在家系內(nèi)正常人及無親緣關(guān)系的健康對照中出現(xiàn)。對PAX9基因的檢測未發(fā)現(xiàn)異常序列。生物信息學預測結(jié)果顯示,該突變使MSX1基因正常的剪切位點消失,突變可能引起了蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)論 1.該家系為常染色體顯性遺傳; 2.家系內(nèi)患者的臨床特征以第二前磨牙及第三磨牙先天缺失較為常見; 3.中國人MSX1基因突變可引起家族性少牙畸形,IVS1-2AG為一個新的突變; 4.該突變擴大了先天性缺牙的基因突變譜,為進一步理解先天性缺牙的遺傳學發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R781
【部分圖文】：

加入 100μlDNA 溶解液，65℃水浴 1 小時使 DNA 充分溶解。 將 DNA 溶液置于 4℃保存?zhèn)溆谩?1.3 基因組 DNA 的備份保存及模板 DNA 的配制：用分光光度計測 DNA 原液的純度和濃度，并分裝成 2～3 管，一份放至 箱保存，剩余的放至 20℃和 4℃保存以做 DNA 檢測分析。根據(jù) DNA 原液濃度配成濃度為 50ng/μl 的模板 DNA。.2 MSX1 和 PAX9 基因引物設(shè)計參照文獻設(shè)計及用 Primer5.0 軟件自行設(shè)計擴增 MSX1 和 PAX9 基因編碼翼區(qū)域的引物。.2.1 MSX1 和 PAX9 基因的序列獲取在NCBI的網(wǎng)頁（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）輸入該基因的名稱，可得到因的mRNA序列（圖1）。

圖2 Human BLAT Search界面Fig 2 The interface of Human BLAT Search 采用Primer 5.0進行引物設(shè)計據(jù)基因mRNA序列與基因組序列的Human BLAT Search的結(jié)果，采用引Primer 5.0，將含有外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界處的基因組序列輸入件中（圖3）。根據(jù)序列長短、合適的起始及終止位置限定設(shè)計條件，中挑選合適的引物。考慮到測序結(jié)果的準確性和測序儀器的誤差，以內(nèi)含子交界50個堿基以內(nèi)序列可能影響mRNA剪切，一般要超出目標序100bp左右。物設(shè)計主要針對基因的編碼區(qū)及其側(cè)翼區(qū)域進行，設(shè)計參照以下原則物的長度控制在16～24 bp。

圖3 Primer5.0引物設(shè)計界面Fig 3 The interface of Primer 5.0表 1 MSX1 基因的引物序列Tab 1 Primer sequences of MSX1 gene used for PCR外顯子 引物(5’ - 3′) 擴增產(chǎn)物長度(bp) 退火溫度（℃1 aF: CTGGCCTCGCCTTATTAGCR: CTTCTGGCAGCTTGAGGAGT661 581 bF: AGTGTCCCCTTCGCTCCTR: CTTCTGGCAGCTTGAGGAGT227 582F: ACTTGGCGGCACTCAATATCR: TGTGAGGGTTAAAGGGAAGG669 58

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本文編號：2831124