目的:探討檸檬精油(Lemon essential oil,LEO)對(duì)不同葡萄糖濃度下變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)產(chǎn)酸及其調(diào)節(jié)機(jī)制的影響,為L(zhǎng)EO在口腔疾病防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法1.最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測(cè)定采用液體稀釋法測(cè)定LEO對(duì)0%、0.2%、1%和5%葡萄糖濃度下S.mutans的最小抑菌濃度。2.產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)得的MIC,分別用0%、0.2%、1%和5%糖濃度的TPY培養(yǎng)基對(duì)LEO對(duì)倍稀釋,每種糖濃度下設(shè)置4個(gè)稀釋濃度,每個(gè)稀釋濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù),不含LEO的培養(yǎng)基(四種糖濃度)作為對(duì)照組。檢測(cè)各組含S.mutans溶液的初始pH值,37℃下厭氧培養(yǎng)24h,再次檢測(cè)各組樣本的pH值,以ΔpH=pH_(最終)-pH_(初始)來(lái)反映LEO對(duì)不同糖濃度下S.mutans的產(chǎn)酸能力的影響。3.乳酸脫氫酶活性的測(cè)定分組方法同實(shí)驗(yàn)2。收集培養(yǎng)18h的S.mutans,冰浴下超聲破碎菌體,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各個(gè)樣本的蛋白質(zhì)濃度,還原性輔酶Ⅰ氧化法測(cè)定各樣本乳酸脫氫酶的活性。4.ldh基因轉(zhuǎn)錄和翻譯量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)同實(shí)驗(yàn)2,每種糖濃度下僅設(shè)置3個(gè)稀釋濃度。將S.mutans加入各組中,37℃下厭氧培養(yǎng)18h后,提取S.mutans的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴(kuò)增,根據(jù)各組2~(-??Ct)值,確定各組S.mutans ldh基因轉(zhuǎn)錄量。分別用0%和1%糖濃度的TPY培養(yǎng)基對(duì)1×MIC的LEO對(duì)倍稀釋,每種糖濃度下設(shè)置3個(gè)稀釋濃度,每個(gè)稀釋濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù),不含LEO的培養(yǎng)基(0%和1%糖濃度)作為對(duì)照組。將S.mutans加入各組培養(yǎng)基中,37℃下厭氧培養(yǎng)18h后,采用SDS-PAGE測(cè)定ldh基因的翻譯量。結(jié)果1.MIC測(cè)定結(jié)果:LEO在0%和5%糖濃度下的MIC為1.125mg/ml,在0.2%和1%糖濃度下的MIC為2.25mg/ml。2.LEO對(duì)0%、0.2%、1%和5%糖濃度下S.mutans產(chǎn)酸的影響結(jié)果(1)對(duì)照組S.mutans產(chǎn)酸的影響結(jié)果在對(duì)照組,隨著葡萄糖濃度的升高(0.2%~5%糖濃度),培養(yǎng)基的ΔpH值逐漸增大,均高于0%糖濃度組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1913.266,P0.05),說(shuō)明高濃度葡萄糖更有利于S.mutans產(chǎn)酸。(2)LEO對(duì)S.mutans的產(chǎn)酸影響結(jié)果在無(wú)糖(0%糖濃度)環(huán)境下,僅MIC組ΔpH值低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.953,P0.05),提示在無(wú)糖環(huán)境下,亞抑菌濃度的LEO對(duì)S.mutans的產(chǎn)酸無(wú)影響。在有糖(0.2%~5%糖濃度)環(huán)境下,隨著LEO濃度的升高,各糖濃度下S.mutans的ΔpH值逐漸降低,除0.563mg/ml(0.2%糖濃度1/4MIC)以下濃度外,所有LEO組的ΔpH值均低于相同糖濃度下的對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_(0.2%)=197.287,F_(1%)=2229.371,F_(5%)=2603.091,P0.05),提示在一定濃度范圍內(nèi),亞抑菌濃度的LEO對(duì)高糖、中糖和低糖環(huán)境下的S.mutans產(chǎn)酸均有抑制作用,作用具有濃度依賴(lài)性。3.LEO對(duì)0%、0.2%、1%和5%糖濃度下S.mutans乳酸脫氫酶活性的影響結(jié)果(1)對(duì)照組S.mutans的乳酸脫氫酶活性的影響結(jié)果在對(duì)照組,隨著葡萄糖濃度的升高(0.2%~5%糖濃度),S.mutans的乳酸脫氫酶活性逐漸增大,均高于0%糖濃度組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=335.297,P0.05),提示高濃度的葡萄糖更有利于S.mutans乳酸脫氫酶活性的提高。(2)LEO對(duì)S.mutans的乳酸脫氫酶活性的影響結(jié)果在無(wú)糖(0%糖濃度)環(huán)境下,隨著LEO濃度的升高,實(shí)驗(yàn)組的乳酸脫氫酶活性逐漸降低,各組的乳酸脫氫酶活性均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_(0%)=60.85,P0.05),提示LEO在無(wú)糖環(huán)境下可以抑制S.mutans乳酸脫氫酶活性,抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在有糖(0.2%~5%糖濃度)環(huán)境下,隨著LEO濃度的升高,各糖濃度下S.mutans的乳酸脫氫酶活性均逐漸降低,除0.141 mg/ml(0.2%糖濃度1/16MIC)外,實(shí)驗(yàn)組的乳酸脫氫酶活性均低于相同糖濃度下的對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_(0.2%)=78.867,F_(1%)=77.071,F_(5%)=255.594,P0.05),提示在低糖、中糖和高糖環(huán)境下,亞抑菌濃度的LEO也可以抑制S.mutans乳酸脫氫酶活性,抑制作用具有濃度依賴(lài)性。4.LEO對(duì)0%、0.2%、1%和5%糖濃度下S.mutans ldh基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響(1)對(duì)照組S.mutans ldh的基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果在對(duì)照組,隨著葡萄糖濃度的升高(0.2%~5%糖濃度),1%和5%糖濃度組S.mutans的ldh基因的轉(zhuǎn)錄量高于0%糖濃度組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.151,P0.05),提示在一定糖濃度下(1%和5%)的葡萄糖可以誘導(dǎo)S.mutans ldh基因的表達(dá)上調(diào)。(2)LEO對(duì)S.mutans ldh基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響結(jié)果在無(wú)糖環(huán)境下(0%糖濃度),各實(shí)驗(yàn)組ldh的基因轉(zhuǎn)錄量均高于對(duì)照組,與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.258,P0.05);0.563 mg/ml(1/2MIC)精油組的ldh基因的翻譯量低于對(duì)照組,0.282mg/ml(1/4MIC)精油組的ldh基因的翻譯量高于對(duì)照組,相比對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=167.193,P0.05),提示在無(wú)糖環(huán)境下,LEO可能有誘導(dǎo)ldh基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的作用,對(duì)ldh基因翻譯具有一定的影響,作用無(wú)明顯規(guī)律。在有糖環(huán)境下,除0.563mg/ml(0.2%糖濃度1/4MIC)外,其余實(shí)驗(yàn)組ldh的基因轉(zhuǎn)錄量均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_(0.2%)=18.009,F_(1%)=316.667,F_(5%)=36.528,P0.05);實(shí)驗(yàn)組的ldh基因合成乳酸脫氫酶的量顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_(1%)=709.001,P0.05),提示在有糖環(huán)境下,LEO可以抑制ldh基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。結(jié)論1、LEO可以抑制0%、0.2%、1%和5%糖濃度下S.mutans產(chǎn)酸。2、在有糖環(huán)境下,亞抑菌濃度的LEO在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí),可以通過(guò)抑制S.mutans ldh基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,降低乳酸脫氫酶的活性,進(jìn)而減少酸的產(chǎn)生。3、在無(wú)糖環(huán)境下,亞抑菌濃度的LEO對(duì)S.mutans ldh基因的轉(zhuǎn)錄可能具有逆調(diào)節(jié)的作用,對(duì)S.mutans ldh基因的翻譯具有一定的影響,作用無(wú)顯著規(guī)律。4、高濃度的葡萄糖可以上調(diào)S.mutans ldh基因的表達(dá)量,提高乳酸脫氫酶的活性,更有利于產(chǎn)酸。5、LEO對(duì)無(wú)糖環(huán)境下S.mutans ldh基因轉(zhuǎn)錄的逆調(diào)節(jié)作用需要從多角度進(jìn)一步研究證實(shí)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R788.1
【部分圖文】：

圖 1-1 S.mutans 顯微鏡下圖（400 倍）。 圖 1-2 S.mutans 純培養(yǎng)鑒定圖。1.2.2 四種糖濃度下 LEO 的最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果液體稀釋法測(cè)得 LEO 在 5%和 0%糖濃度下的最小抑菌濃度為 1.125 mg/ml，在 1%和 0.2%糖濃度下的最小抑菌濃度為 2.25 mg/ml。LEO 在四種糖濃度下對(duì)S.mutans 生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表 1-2。表 1-2 0%、0.2%、1%和 5%葡萄糖濃度下 LEO 對(duì) S.mutans 生長(zhǎng)影響結(jié)果葡糖糖濃度 LEO 濃度4.5 mg/ml 2.25 mg/ml 1.125 mg/ml 0.563 mg/ml 對(duì)照組5% - - - + +1% - - + + +0.2% - - + + +0% - - - + +注：+代表有細(xì)菌生長(zhǎng)，-代表無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖 1-1 S.mutans 顯微鏡下圖（400 倍）。 圖 1-2 S.mutans 純培養(yǎng)鑒定圖。1.2.2 四種糖濃度下 LEO 的最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果液體稀釋法測(cè)得 LEO 在 5%和 0%糖濃度下的最小抑菌濃度為 1.125 mg/ml，在 1%和 0.2%糖濃度下的最小抑菌濃度為 2.25 mg/ml。LEO 在四種糖濃度下對(duì)S.mutans 生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表 1-2。表 1-2 0%、0.2%、1%和 5%葡萄糖濃度下 LEO 對(duì) S.mutans 生長(zhǎng)影響結(jié)果葡糖糖濃度 LEO 濃度4.5 mg/ml 2.25 mg/ml 1.125 mg/ml 0.563 mg/ml 對(duì)照組5% - - - + +1% - - + + +0.2% - - + + +0% - - - + +注：+代表有細(xì)菌生長(zhǎng)，-代表無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

7同葡萄糖濃度下 S.mutans 的產(chǎn)酸結(jié)果，G 代表葡萄糖，*代表各組之較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 對(duì) S.mutans 的產(chǎn)酸的影響結(jié)果 LEO 的情況下，0%、0.2%、1%和 5%糖濃度下 S.mutans 1-4。環(huán)境下，即 0%糖濃度，隨著 LEO 濃度的升高（0.141~1.1的ΔpH 值從 0.360 逐漸降至 0.077，相比對(duì)照組，僅 1.1差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示在 0%糖濃度下, 僅）組LEO對(duì)S.mutans產(chǎn)酸具有抑制作用,亞抑菌濃度的LEO作用。環(huán)境下：0.2%糖濃度下，隨著 LEO 濃度的升高（0.141~1.1的ΔpH 值從 0.580 逐漸降至 0.093，相比對(duì)照組，僅 0.56（l1/2MIC 和 1/4MIC）組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提

【參考文獻(xiàn)】

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