研究目的:通過對健康人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts,HGFs)的原代培養(yǎng),測定其在健康及體外模擬牙周炎狀態(tài)下脂聯(lián)素受體(Adiponectin receptor,AdipoR)信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)的表達,并觀察脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)對牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激HGFs免疫炎癥反應的調控,以初步揭示脂聯(lián)素及其受體對牙周炎的影響,為進一步揭示肥胖相關疾病與牙周炎相關性的內在機制及輔助治療提供實驗依據(jù)。研究方法:選取自2017年03月至2017年05月因拔除埋伏阻生智齒在天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院頜面外科就診的患者(年齡18-24歲,平均年齡22歲),排除患有全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病、心血管病等病史,妊娠,吸煙,近3個月內使用抗生素者,患者知情同意,在術中收集新鮮且色形質健康、無明顯炎癥的的牙齦組織。(1)運用組織塊貼壁法從體外培養(yǎng)HGFs,選取4-6代細胞進行實驗。(2)從健康HGFs中提取總RNA,逆轉錄法合成互補的DNA(complementary DNA,cDNA),反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測HGFs中脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)mRNA表達。(3)分別用P.g LPS、TNF-α、APN刺激HGFs 24h。細胞刺激情況如下:TNF-α50ng/ml,P.g LPS 0.1μg/ml,APN 1μg/ml,空白對照(10%FBS培養(yǎng)基)。(4)上述方法刺激細胞后,運用實時定量聚合酶鏈式反應(real time polymerase chain reaction,real-time PCR)檢測不同時間點(0、0.5、12、24h)HGFs中脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)mRNA表達水平。(5)分別用P.g LPS、APN+P.g LPS刺激HGFs達24h。細胞刺激的情況如下:2μg/ml P.g LPS,2μg/ml P.g LPS+1μg/ml APN,空白對照(10%FBS培養(yǎng)基)。(6)上述方法刺激細胞后,運用real-time PCR法檢測不同時間點(6、8、24h)HGFs中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(Prostaglandin-E2,PGE_2)、基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)的mRNA表達水平。(7)采用IBM SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,做描述性分析;計數(shù)資料表示:均數(shù)±標準差;單因素分析采用One-way ANOVA來分析,析因設計采用析因分析,當p0.05時認為有統(tǒng)計學差異。結果:(1)運用組織塊貼壁法從組織塊中成功培養(yǎng)出HGFs。在顯微鏡下仔細觀察顯示:原代培養(yǎng)約6-8天后有細胞從組織塊中爬出,傳代后細胞形態(tài)為趨于一致的長梭形。免疫組化結果顯示:細胞抗角蛋白染色呈現(xiàn)陰性,抗波形絲蛋白染色呈現(xiàn)陽性,證實我們培養(yǎng)的細胞為來源于中胚層的人牙齦成纖維細胞。(2)RT-PCR顯示人牙齦成纖維細胞均表達AdipoR1和AdipoR2,其中AdipoR2條帶亮度較AdipoR1亮度更高,提示在牙齦結締組織中成纖維細胞脂聯(lián)素受體可能主要以AdipoR2為主,進一步探討需siRNA實驗和蛋白實驗證實。(3)與空白對照組相比,TNF-α下調了HGFs的AdipoR2 mRNA表達(p0.05),P.g LPS與APN明顯上調了HGFs的AdipoR1/R2 mRNA的表達(p0.05)。(4)P.g LPS促進HGFs分泌PGE_2、IL-6、MMP-1及TNF-α,在P.g LPS各炎性介質最佳刺激時間點,APN可顯著抑制P.g LPS刺激HGFs分泌IL-6及MMP-1(p0.05),APN可促進P.g LPS刺激HGFs分泌PGE_2和TNF-α,但與P.g LPS對照組相比無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:(1)脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)在人牙齦成纖維細胞中均有表達,且主要以AdipoR2為主,提示脂聯(lián)素可以通過內分泌方式作用于牙周組織。(2)APN可抑制P.g LPS刺激HGFs分泌IL-6及MMP-1,抑制病原微生物在牙周炎致病過程中所起的作用,產(chǎn)生抗炎、抗骨吸收和基質降解等作用。。(3)在牙周炎癥狀態(tài)下,脂聯(lián)素與其受體作用效能下降,致使已有的牙周炎癥進一步加重,及時清創(chuàng)治療和輔助APN等局部藥物治療對于控制炎癥、防止病情加重意義重大。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R781.42
【部分圖文】：

一、HGFs 中脂聯(lián)素受體的表達及 TNF-α、P.g L醫(yī)科大學碩士學位論文 對其影響 原代培養(yǎng)的 HGFs 的形態(tài)學觀察在靜置 4 小時后，我們可見大多數(shù)的牙齦組織貼附在細胞培養(yǎng)瓶底后，在倒置顯微鏡下可見組織塊邊緣隱隱約約有成纖維細胞樣呈梭形（圖 1A），在游出細胞的頭部我們可見到其偽足結構十分清晰，并極性很強，在生長很密集的地方，我們可以看到細胞排列呈現(xiàn)十分明形狀，同時伴隨著原代培養(yǎng)時間的延長，牙齦組織塊四周顯示細胞密，并彼此融合同時與從相鄰的組織塊爬出的細胞相互交匯（圖 1B）至培養(yǎng)瓶 80%時，即可傳代，傳代后我們發(fā)現(xiàn)細胞呈長梭形，部分原代培養(yǎng)和傳代生長的 HGFs 細胞均呈現(xiàn)成纖維細胞樣，而且在其四看到多個突起，在細胞的中央可見圓形或卵圓形的細胞核，核內核細胞呈分裂相，細胞整體走向為放射狀、漩渦狀走行（圖 1C、D）果

RT-PCR檢測在健康HGFs中AdipoR1、AdipoR2的表達Figure3TheexpressionofAdipoR1andAdipoR2inhealthyHGFsviaRT-PCR

圖 2 HGFs 組織來源的鑒定（免疫組織化學 SP 法)Figure 2 Identification of source of HGFs(Immunohistochemistry SP) 健康 HGFs 脂聯(lián)素受體的表達.1 RNA 樣品純度的測定根據(jù) 260nm 及 280nm 處吸光度數(shù)值計算:OD260/OD280=0.496/0.271抽提的 RNA 純度是較高的。.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的結果HGFs 有 AdipoR1、AdipoR2 的表達，且瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)基因片段與預期一致（圖 3）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 張欣;徐蓓蕓;俞立英;;脂聯(lián)素對Ⅱ型糖尿病患者伴牙周炎的影響[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2011年05期

2 于艷玲;許麗華;王俊霞;尤紅煜;楊冬茹;;內毒素對牙齦成纖維細胞增殖活性及分泌基質金屬蛋白酶的影響[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志;2010年01期

3 李春霖,龔燕平,田慧,陸菊明,李明,肖或君,母義明,潘長玉;脂聯(lián)素受體在正常Wistar大鼠各組織的分布和表達[J];解放軍醫(yī)學雜志;2005年08期

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相關碩士學位論文 前1條

1 劉洋;羅格列酮對牙周炎大鼠牙齦組織ADPR1 mRNA和ADPR2 mRNA表達的影響[D];鄭州大學;2016年

本文編號：2822472