研究背景與目的:牙周病治療的最終目標是使因炎癥破壞的牙周組織得到再生和重建,基于干細胞、支架材料、生長因子的組織工程技術(shù)為牙周組織再生提供了有效的思路和方法。雖然間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植治療在再生醫(yī)學領域取得了一定的效果,但仍存在所需細胞量大、生存率低、致瘤和致畸等安全性問題,因此亟需新的方法以促進組織再生。越來越多的研究表明,干細胞的旁分泌功能,即干細胞移植后分泌的生長因子、細胞因子是干細胞促進組織再生的主要機制。相比于干細胞移植,間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液(Conditioned medium from MSCs,MSCs-CM)使用更加方便安全,具有更好的臨床轉(zhuǎn)化前景。牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是來源于牙周膜的一種成體干細胞,被認為是牙周再生治療中較理想的種子細胞。研究表明應用PDLSCs移植或者PDLSCs-CM均獲得了一定程度的牙周組織再生。然而,體外獲取PDLSCs需要有多個拔除牙齒的牙周膜,培養(yǎng)成功率較低,分離獲得周期較長。因此,PDLSCs在牙周再生治療中的廣泛應用受到了很大限制。牙齦干細胞(Gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)是從牙齦中分離出來的間充質(zhì)干細胞,具有自我更新、多向分化潛能等間充質(zhì)干細胞的特性,用于牙周組織再生,亦取得了一定效果。相比于牙周膜干細胞,GMSCs取材方便,易于培養(yǎng),免疫調(diào)節(jié)功能更加優(yōu)越,因此GMSCs在牙周再生方面有更好的臨床應用前景。目前還未見有牙齦間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液用于牙周組織再生的研究。因此,本研究的目的是利用大鼠下頜第一磨牙牙周骨缺損模型,研究GMSCs-CM對牙周缺損再生的效果,并且與PDLSCs-CM進行比較,為GMSCs-CM的應用提供理論依據(jù)。研究方法:濃縮CM的制備:取臨床健康的人牙齦組織,組織塊法培養(yǎng)并傳代獲得人牙齦成纖維細胞(gingival fibroblasts,GFs),有限稀釋法克隆化分離培養(yǎng)獲得GMSCs,PDLSCs是張春澍同學慷慨相贈。上述細胞在生長培養(yǎng)基MEM中生長至融合后,換用無血清MEM繼續(xù)培養(yǎng)48小時,收集各組無細胞、無血清的條件培養(yǎng)液,超濾離心管濃縮100倍,BCA法測定各組蛋白質(zhì)濃度。大鼠牙周缺損模型的建立及分組處理:外科方法建立大鼠左側(cè)下頜第一磨牙頰側(cè)牙周骨缺損模型,Bio-gide膠原膜負載各組條件培養(yǎng)液,移植至牙周缺損,嚴密縫合。共分為五組:對照組,僅放置膠原膜;無血清培養(yǎng)基組(MEM組),膠原膜負載不含血清的濃縮α-MEM;GFs-CM組,膠原膜負載牙齦成纖維細胞濃縮條件培養(yǎng)液;GMSC-CM組:膠原膜負載牙齦干細胞濃縮條件培養(yǎng)液;PDLSCs-CM組:膠原膜負載牙周膜干細胞濃縮條件培養(yǎng)液。標本處理及分析:分別于術(shù)后1周、2周、4周處死動物,取左側(cè)下頜第一磨牙及牙周組織,脫鈣,石蠟包埋,進行HE及Masson染色,組織學觀察并測量,統(tǒng)計學分析各組牙周再生的情況。進行腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、-10 的免疫組化染色及分析,分析各組炎癥因子表達情況。對各組標本進行骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、Runt有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),免疫組化染色,以分析成骨細胞分化情況。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

消毒鋪巾。注射適量甲哌卡因局部浸潤后，沿左側(cè)下頜骨下緣做一長約逡逑１．５ｃｍ的口外切口，分離皮下筋膜，暴露咬肌，切斷咬肌筋膜，剝離骨膜，翻開逡逑暴露骨面（圖１Ａ），避免損傷重要的血管、神經(jīng)。用渦輪機手機仔細地磨除下逡逑頜從第一磨牙近中至第二磨牙近中的頰側(cè)牙槽骨，冠方去除至牙槽嵴頂，根方到逡逑達根尖區(qū)，徹底刮除根面牙周膜、牙骨質(zhì)，建立一個長、高３＿＊２＿牙周缺逡逑損，深約１ｍｍ邋（圖１Ｂ），手術(shù)過程中用大量生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)。無菌棉球吸千，逡逑根據(jù)分組，分別將負載各組濃縮條件培養(yǎng)液，即ＭＥＭ，ＧＦｓ－ＣＭ，ＧＭＳＣｓ－ＣＭ，逡逑ＰＤＬＳＣｓ－ＣＭ，以及無菌生理鹽水的膠原膜植入缺損內(nèi)（圖１Ｃ）。咬肌復位，５－０逡逑縫線縫合肌層，復位皮膚采用３－０的縫線縫合，再次碘伏消毒傷口。術(shù)后密切觀逡逑１３逡逑

邐山東大學碩士學位論文邐逡逑結(jié)果逡逑１．１邐ＧＭＳＧｓ分離、培養(yǎng)及鑒定逡逑１．１．１邐ＧＭＳＣｓ的分離與培養(yǎng)逡逑組織塊培養(yǎng)７到１０天左右可觀察到組織塊周圍有長梭形細胞生長，圍繞組逡逑織塊向周圍擴展，增殖快速（圖２Ａ）。高倍鏡下，細胞呈成纖維細胞形態(tài)，細胞逡逑核居中（圖２Ｂ）。有限稀釋單個細胞約５天開始形成包含多個細胞的集落，細胞逡逑形態(tài)相似，呈長梭形，細胞增殖迅速，約２周時，集落中心細胞密集，呈菊花狀，逡逑向周圍放射排列（圖２Ｃ）。２周時結(jié)晶紫染色，可見培養(yǎng)皿底部多個淡藍色斑點逡逑（圖２Ｄ），邋ＧＭＳＣｓ的克隆形成率為２２％土２．９％。逡逑

逡逑１．邋１．２．邋２邋ＧＭＳＣｓ多向分化潛能檢測：經(jīng)成骨培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)２８天后，ＧＭＳＣｓ呈逡逑多層生長，茜素紅染色可觀察到鈣結(jié)節(jié)（圖３Ｂ）。ＧＭＳＣｓ經(jīng)成脂培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導逡逑１４天后，油紅染色可見紅色的脂肪微粒（圖３Ｃ），顯示ＧＭＳＣｓ具有向成脂肪細逡逑胞分化的能力。逡逑Ａ邋Ａ０１邋ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ａ０２ＣＯ－３４邐Ａ０３邋ＣＯ－４５逡逑ｇ邋0ｍ邋Ｐｔ邋邐邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１邐邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１逡逑＾邋＾邋＾邋Ｊｉ邋＾邋＾邋Ｊｌ邐＾邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋＾逡逑ＰＥ邋Ａ邐ＰＣ邋Ａ邐Ｘ．Ａ逡逑Ａ０４ＣＯ－９０邐Ａ０６邋ＣＯ－４４邐Ａ0５邋ＣＤ－１０５逡逑｜邋０＾邋Ｐｔ邐邋｜邋０0？邋Ｐ１邐邋Ｉ邋Ｑ？ｔｅ邋Ｐｉ邐邐逡逑？邋Ｉ邋！邐？邋Ｉ逡逑ｊｙｉ逡逑Ｊ？Ｏｋｌ邋．ＵＫ邋．邋．Ｊ？Ｊｕ逡逑＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ２邐＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋Ｊｉ逡逑＿＿：}瑁咤危沐澹渝義賢跡沖澹牽停櫻茫蟾上赴約ㄥ義希粒毫魘較赴跫觳猓牽停櫻茫蟊礱姹曛疚锏謀澩錚唬攏哄澹牽停櫻茫蟪曬橋嘌觳舛嘞蚍皺義匣蹦埽曬怯盞寂嘌玻柑歟嘌蟮撞啃緯傻能縊睪旖嶠阱�？￣４e埃埃�、硲亓x現(xiàn)盞跡洛澹牽停櫻茫缶芍盞寂嘌保刺

本文編號：2820349