背景 牙齒的發(fā)育是一個牙源性上皮與間充質相互誘導、相互作用的復雜的生物學過程。在牙源性上皮的誘導下,牙源性間充質進一步分化形成牙本質和牙髓,而牙源性上皮也在牙源性間充質的誘導下發(fā)育形成成釉器。所以,牙源性上皮在牙齒的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育成熟中發(fā)揮著重要的作用。 目前應用于組織工程的干細胞主要有兩種即胚胎干細胞和成體干細胞。但由于胚胎干細胞的應用受倫理學方面影響,所以組織工程種子細胞只能從成體干細胞方面考慮。脂肪來源的干細胞是成體干細胞的一種,具有所有干細胞的特性,體外培養(yǎng)有多項分化的能力,可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞、肌肉細胞、心肌細胞及神經(jīng)細胞。與其它成體干細胞相比脂肪來源的干細胞具有取材容易,獲得率高,對組織損傷小等特點,故在組織工程中有著重要的位置,是一種良好的種子細胞。 目的 本研究旨在通過體外及體內(nèi)實驗探討大鼠切牙Apical bud上皮細胞誘導大鼠脂肪來源的干細胞向成牙本質細胞分化的能力。 方法 1.大鼠Apical bud上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定 取出生后4 d大鼠仔鼠切牙的Apical bud組織,采用酶消化法和差別消化法原代培養(yǎng)獲得大鼠切牙的Apical bud上皮細胞,并通過免疫組織化學染色檢測CK14、抗釉原蛋白、抗波形絲蛋白。 2.大鼠脂肪來源干細胞的培養(yǎng)及多向分化能力探討 取出生后4 d的大鼠腹股溝處的脂肪組織,酶消化法原代培養(yǎng)獲得脂肪來源的干細胞。油紅O染色鑒定成脂誘導;茜素紅染色鑒定成骨誘導;神經(jīng)細胞分子標志神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100蛋白免疫細胞化學染色鑒定成神經(jīng)誘導。 3.大鼠切牙Apical bud上皮誘導脂肪干細胞(ADSCs)成牙本質樣分化實驗 3.1體外實驗:生長良好的第三代大鼠脂肪來源干細胞,培養(yǎng)于Apical bud上皮細胞的條件培養(yǎng)液中,觀察細胞的生長和形態(tài)變化。誘導7 d后,采用免疫組化法檢測牙本質涎磷蛋白(DSPP)的表達,RT-PCR檢測牙本質涎磷蛋白(DSPP)和牙本質基質蛋白(DMP-1)的表達。 3.2體內(nèi)實驗:取生長良好的第三代脂肪來源的干細胞,加入5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,制成細胞懸液,將分離好的Apical bud上皮放入懸液中,離心獲得重組細胞團,加入20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,在37℃,5% CO2飽和濕度條件下過夜培養(yǎng)。次日將重組細胞團植入大鼠腎被膜下。8周后腎被膜下取材,分別采用HE染色、Masson三色法和免疫組化方法對移植生成物進行組織學檢測。 結果 1.大鼠Apical bud上皮細胞:酶消化法獲得的原代上皮細胞為混雜細胞,呈長梭狀的細胞為成纖維樣細胞,呈多角形的是上皮樣細胞,上皮樣細胞被成纖維樣細胞包繞,呈“島”樣分布。經(jīng)過2至3次差別消化,成纖維樣的細胞被完全去除,貼壁細胞全部為上皮樣細胞。免疫組化檢測CK14表達陽性;釉原蛋白表達陽性;抗波形絲蛋白表達陰性。 2.大鼠脂肪來源干細胞:原代細胞呈小多角形或短梭形,單核,有時突起較多,并存在一些多脂滴細胞,經(jīng)傳代后多脂滴細胞減少,脂肪干細胞突起減少,呈小多角形或短梭形,生長較快,在傳代過程中未見形成自發(fā)鈣結節(jié),也未見到向成熟脂肪細胞。成脂誘導后,油紅O染色可見成紅色的脂滴顆粒,證實ADSCs成脂分化。成骨誘導中,茜素紅染色可見呈橘紅色鈣鹽沉積,證實ADSCs成骨分化。脂肪來源的干細胞向成神經(jīng)方向誘導的過程中,神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100蛋白染色均為陽性結果,證實ADSCs成神經(jīng)分化。 3.體外誘導實驗結果: Apical bud上皮細胞的條件培養(yǎng)液可誘導脂肪來源干細胞發(fā)生形態(tài)學變化,均可見細胞變長,并出現(xiàn)極性改變,細胞呈平行排列的趨勢。免疫組化均可見DSPP呈陽性染色。RT-PCR檢測顯示DSPP和DMP-1表達。 4.體內(nèi)誘導實驗結果:Apical bud上皮細胞和脂肪來源干細胞重組體腎被膜下生成物的HE染色可見管樣牙本質和骨樣牙本質樣結構;Masson三色法可以觀察到有綠色的牙本質樣結構;免疫組化檢測中CK14染色陽性,DSPP染色陽性。 結論 1.采用酶消化法和差別消化法能夠原代培養(yǎng)獲得大鼠切牙的Apical bud上皮細胞; 2.采用酶消化法能夠原代培養(yǎng)獲得大鼠脂肪來源干細胞,并證實其具有多向分化能力; 3. Apical bud上皮細胞在體外能夠誘導脂肪來源的干細胞向成牙本質細胞分化; 4. Apical bud上皮與脂肪來源的干細胞重組在體內(nèi)可以構建出牙本質樣結構。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

31圖1.1 大鼠切牙Apicalbud 上皮細胞形態(tài)(×40) 圖1.2.3 上皮細胞抗波形絲蛋白陰性(免疫組化×200)圖 1.2.1 上皮樣細胞抗 CK-14 染色陽性(免疫組化×400)圖 1.2.2 上皮細胞抗釉原蛋白染色陽性(免疫組化×400)圖 2

31圖1.1 大鼠切牙Apicalbud 上皮細胞形態(tài)(×40) 圖1.2.3 上皮細胞抗波形絲蛋白陰性(免疫組化×200)圖 1.2.1 上皮樣細胞抗 CK-14 染色陽性(免疫組化×400)圖 1.2.2 上皮細胞抗釉原蛋白染色陽性(免疫組化×400)圖 2.1 脂肪來源的干細胞形態(tài)(×40) 圖 2

圖 1.2.1 上皮樣細胞抗 CK-14 染色陽性(免疫組化×400)圖 1.2.2 上皮細胞抗釉原蛋白染色陽性(免疫組化×400)圖 2.1 脂肪來源的干細胞形態(tài)(×40) 圖 2.3 脂肪來源的干細胞成脂誘導后油紅 O 染色(×200)

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本文編號：2814368