目的：用攜帶人骨保護素（human osteoprotegerin, hOPG）基因的腺病毒載體Ad5-hOPG-EGFP轉(zhuǎn)染Beagle犬自體牙周韌帶細胞（Periodontal ligament cells,PDLCs），并與引導(dǎo)組織再生膠原膜BME-10X復(fù)合工程化，將此復(fù)合物植入Beagle犬Ⅱ°根分叉病變區(qū)，探討hOPG基因修飾的組織工程化復(fù)合物修復(fù)自體牙周組織缺損的能力及其促進牙周組織再生的能力。 方法：1.體外分離人牙周韌帶細胞，采用改良組織塊法，分別用MEM-α、DMEM-LG和RPMll640三種培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)基對人牙周韌帶細胞體外生物學(xué)行為的影響。2.體外分離培養(yǎng)Beagle犬PDLCs，采用改良組織塊法培養(yǎng)，免疫細胞化學(xué)法鑒定細胞來源。3.體外構(gòu)建攜帶hOPG基因的腺病毒載體Ad5-hOPG-EGFP，并將其轉(zhuǎn)染Beagle犬PDLCs，通過流式細胞術(shù)、RealTime PCR、ELISA以及Western Blot檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達。4.體外hOPG基因轉(zhuǎn)染Beagle犬PDLCs后，熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，MTT法描繪細胞生長曲線，流式細胞技術(shù)檢測細胞的周期變化及凋亡情況，Von Kossa染色觀察礦化結(jié)節(jié)生成，Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染細胞中犬ALP、OC、BSP成骨指標的表達變化，ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后12天內(nèi)hOPG、cRANKL/cOPG的變化情況。5.轉(zhuǎn)染hOPG基因的Beagle犬PDLCs與膠原膜BME-10X復(fù)合，采用熒光倒置相差顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、掃描電鏡觀察兩者復(fù)合情況。6.將復(fù)合的組織工程化復(fù)合物植入16只裸鼠皮下，分別于6周、12周取材拍攝X線片及制作病理切片，HE染色觀察基因修飾的工程化復(fù)合物在體內(nèi)再生情況。7.人工構(gòu)建6只Beagle犬雙側(cè)下前磨牙Ⅱ°根分叉病變模型，將轉(zhuǎn)染hOPG基因的Beagle犬PDLCs與膠原膜BME-10X復(fù)合，同時設(shè)立轉(zhuǎn)染空載及未轉(zhuǎn)染的細胞復(fù)合物組、空白膜對照組，分別植入根分叉缺損區(qū)，術(shù)后6周及12周時拍攝X線片，并于術(shù)后12周時處死動物，取受試區(qū)牙及牙槽骨，制備頰舌向病理切片，HE染色，通過測量新生牙槽骨面積、新生牙骨質(zhì)面積觀察牙周組織再生情況，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：1.α-MEM培養(yǎng)基促進PDLCs增殖，DMEM-LG促進PDLCs分化。2.成功分離培養(yǎng)了Beagle犬PDLCs。3.通過重組腺病毒Ad5-hOPG-EGFP對Beagle犬PDLCs成功進行轉(zhuǎn)染。腺病毒轉(zhuǎn)染72h后轉(zhuǎn)染效率達到80%以上，轉(zhuǎn)染的細胞發(fā)出較強的綠色熒光。RealTime PCR、ELISA以及Western Blot檢測表明，hOPG在Beagle犬PDLCs中得到了有效表達。4.hOPG基因轉(zhuǎn)染后PDLCs形態(tài)略有變化，增殖能力及細胞周期無明顯變化，未見明顯凋亡，礦化結(jié)節(jié)增大，cALP、cOC、cBSP表達量增高，轉(zhuǎn)染后12天內(nèi)hOPG分泌量逐漸增高，cRANKL/cOPG呈下降趨勢。5.轉(zhuǎn)染細胞在膠原膜中貼附、伸展，生長良好。在激光共聚焦顯微鏡下可見發(fā)出綠色熒光的細胞附著于膠原膜，分層掃描可見各層膠原膜均有不同數(shù)量的PDLCs附著。6.細胞膠原膜復(fù)合物植入裸鼠皮下后，轉(zhuǎn)染細胞與BME-10X形成類骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。7.動物實驗結(jié)果：hOPG-PDLCs—BME-10X組新生牙骨質(zhì)長度百分比較空載-PDLCs—BME-10X組、PDLCs—BME-10X組及BME-10X組高（P0.05），而其余三組之間無顯著性差異。hOPG-PDLCs—BME-10X組、空載-PDLCs—BME-10X組及PDLCs—BME-10X組的新生牙槽骨面積百分比均較BME-10X組高（P0.05），其中hOPG-PDLCs—BME-10X組又較空載-PDLCs—BME-10X組及PDLCs—BME-10X組高（P0.05），而空載-PDLCs—BME-10X組與PDLCs—BME-10X組之間無顯著性差異。 結(jié)論：1.根據(jù)實驗要求選擇合適培養(yǎng)基。2.hOPG基因可在PDLCs中有效表達。3.hOPG基因轉(zhuǎn)染可以加速PDLCs向成骨細胞表型轉(zhuǎn)化，hOPG基因轉(zhuǎn)染的PDLCs有望成為牙周組織工程理想的種子細胞。4.hOPG基因轉(zhuǎn)染的PDLCs在膠原膜BME-10X上生長良好，hOPG基因轉(zhuǎn)染的PDLCs與膠原膜復(fù)合物有望應(yīng)用于牙周組織工程。5. hOPG基因轉(zhuǎn)染的PDLCs與膠原膜復(fù)合物可以促進牙周組織缺損的再生修復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

三組培養(yǎng)基原代細胞的游出情況

梭形生長（圖 1-1）。細胞生長到一定密度后，三組細胞均呈柵欄狀或漩渦狀生長（圖1-2）。三組細胞在細胞游出 7 至 10 天，均可傳代培養(yǎng)。但傳代后，α-MEM 和DMEM-LG 組細胞較短天數(shù)內(nèi)可以再次傳代，RPMI 1640 組則需多培養(yǎng)幾日才可再次傳代。

A：波形絲蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)著棕色（×200）；B：角蛋白染色陰性，胞漿內(nèi)不×100)。圖 1-3 細胞來源鑒定MTT 法檢測牙周韌帶細胞的增殖曲線：比較 3 組細胞增殖情況，從第 3d 起，α-MEM 組細胞生長就顯著快于其，組間有顯著性差異（P<0.05）。第 6d 起，DMEM-LG 組和 RPMI 1640顯著性差異（P<0.05）（圖 1-4）。

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐曉滿;張瑞敏;;組織工程及其他技術(shù)在牙周炎治療中的研究與前景[J];中國組織工程研究;2014年02期

本文編號：2812876