【摘要】：研究目的牙齦間充質干細胞(Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是一種易于獲取、體外培養(yǎng)增殖能力強以及具有多向分化能力的干細胞,可通過各種免疫調節(jié)特性發(fā)揮生物治療作用。巨噬細胞(Macrophages,Mφ)是炎癥修復中的免疫明星細胞,在抗炎和組織修復過程中起重要作用。根據不同微環(huán)境信號,巨噬細胞可以分化成兩種類型,即促炎性M1巨噬細胞(M1 Mφ)和抗炎性M2巨噬細胞(M2 Mφ)。本實驗目的通過比較不同來源的人巨噬細胞生物學特征,選擇最合適的巨噬細胞極化方案,研究了GMSCs對氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導的人炎性巨噬細胞極化的影響,希望為GMSCs治療高脂血癥牙周病的臨床應用提供理論依據和新思路。實驗方法1、利用密度梯度離心法和磁珠分離法從人靜脈血中獲得高純度的外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的誘導下獲得PBMC Mφ;用佛波酯(PMA)誘導人單核細胞系THP-1分化形成THP-1 Mφ;兩組Mφ再分別向M1和M2兩種極化類型誘導分化。在高倍鏡下觀察細胞形態(tài)變化和粘附情況;通過流式細胞術和PCR檢測細胞內M1和M2型相關極化標記表達;通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測量培養(yǎng)上清液的細胞因子分泌水平變化。2、收集因阻生齒或正畸治療而拔牙過程中廢棄的健康牙齦結締組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)獲得GMSCs;經過細胞集落形成實驗、成骨/成脂誘導分化實驗和流式細胞術分析牙齦細胞的干細胞特征;通過Transwell小室建立M1 Mφ和GMSCs非接觸式共培養(yǎng)模型,并用ox-LDL刺激24 h。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),通過ELISA檢測收集上清液的細胞因子分泌變化,用流式細胞術和PCR分析巨噬細胞中M1和M2相關極化標記表達,通過油紅O染色并定量分析細胞內脂滴變化。實驗結果1、兩組懸浮細胞牢固粘附后,觀察到典型的Mφ形態(tài);PCR和流式細胞術結果顯示,兩種Mφ均在M1極化因子(LPS/IFN-γ)誘導后,TNF-α和IL-1β的mRNA水平顯著上調(P0.05),CD86的表達明顯增加(P0.05)。在M2極化因子(IL-4)誘導后,MRC1和IL-10 mRNA水平上調(P0.05);CD206在PBMC Mφ中表達顯著增強(P0.05),而在THP-1 Mφ中沒有差異(P0.05)。ELISA結果顯示,在M1極化誘導后,THP-1 Mφ的培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α分泌水平比PBMC Mφ更高(P0.05)。2、通過酶消化法可以有效獲取GMSCs。流式細胞儀檢測P4代細胞表面干細胞標志物發(fā)現GMSCs陽性表達CD73、CD90和CD105,而幾乎不表達CD45;集落形成分析表明細胞更新和增殖能力強;GMSCs可以在特定誘導條件下分化成脂肪細胞和成骨細胞,提示具有多向分化潛能;GMSCs與ox-LDL誘導下的M1 Mφ共培養(yǎng)后,Mφ的偽足明顯減少,形態(tài)變圓鈍;PCR結果顯示GMSCs顯著降低M1 Mφ中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因水平(P0.05),并且增加了MRC1和IL-10的基因水平(P0.05)。上清液中細胞因子的分泌水平不同,共培養(yǎng)組中TNF-α顯著降低(P0.05),而IL-6、IL-1β相對增加(P0.05)。流式細胞儀檢測分析表明,GMSCs顯著降低細胞表面CD86和HLA-DR的表達(P0.05)。油紅O染色顯示共培養(yǎng)組Mφ中積聚的脂滴較少(P0.05)。結論THP-1 Mφ與PBMC Mφ有相似的極化表達,THP-1更適合M1極化而非M2極化的研究;通過酶消化法從牙齦組織中分離的GMSCs被鑒定具有干細胞特征;GMSCs通過旁分泌作用抑制ox-LDL刺激后M1巨噬細胞的活化及誘導M2表型,調節(jié)炎癥反應,并且影響巨噬細胞脂質代謝。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R781.42

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本文編號：2805681