【摘要】： 實驗?zāi)康模?1.觀察研究HIF-1α在口腔鱗狀細胞癌中表達及與CEACAM1、VEGF-C表達的關(guān)系,分析CEACAM1對血管和淋巴管生成的影響,初步探討HIF-1α、CEACAM1、VEGF-C在口腔癌血管和淋巴管生成中的作用及可能的機制。 2.觀察RNAi基因沉默HIF-1α對舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113表達HIF-1α的影響,并觀察研究HIF-1α基因沉默對CEACAM1和VEGF-C表達的影響,探討HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C的調(diào)控關(guān)系及在腫瘤脈管生成中的作用機制。 3.以口腔癌裸鼠移植瘤模型為研究對象,研究HIF-1α基因沉默對腫瘤CEACAM1和VEGF-C表達的影響,驗證HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C對腫瘤血管和淋巴管生成的作用,以及對腫瘤增殖和進展的影響；探討HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C通路對腫瘤脈管生成及其正常化的影響及作用機制。 研究方法： 1.以人口腔鱗狀細胞癌為研究對象,檢測人口腔鱗狀細胞癌中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C表達 收集2005-2007年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔癌手術(shù)標本91例,其中包括舌鱗狀細胞癌標本30例。患者臨床資料包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度。應(yīng)用免疫組化方法檢測HIF-1α和CEACAM1在91例口腔鱗狀細胞癌中的表達及定位,并對免疫組化結(jié)果進行分析,評價蛋白的表達與臨床資料之間的關(guān)系。檢測30例舌鱗狀細胞癌中VEGF-C表達,并與HIF-1α和CEACAM1在舌癌中的表達進行對比,統(tǒng)計分析HIF-1α與CEACAM1和VEGF-C在舌癌中表達的相關(guān)性,并進一步分析在HIF-1α高表達情況下,CEACAM1表達與腫瘤脈管生成的關(guān)系。 2.以人口腔癌為研究對象,檢測人口腔癌中MVD和LVD以及脈管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化情況 采用免疫組化方法,分別應(yīng)用血管標記CD31和淋巴管標記LYVE-1檢測口腔癌中血管和淋巴管生成情況,統(tǒng)計血管密度和淋巴管密度。免疫組化雙標記和免疫熒光雙標記檢測新生脈管表型轉(zhuǎn)化情況,并分析其與CEACAM1表達的關(guān)系。 3、以人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113細胞為研究對象,檢測RNAi慢病毒干擾載體對Tca8113細胞HIF-1α基因的干擾效率 Tca8113細胞在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的細胞以4×104／孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2m1DMEM培養(yǎng)基。48小時后,細胞融合率可達到30-50%。將細胞分為空白對照組、陰性載體對照組和干擾組,分別加入ENi.S.、NC-GFP-Lentivirus和HIF-1 a-RNAi-Lentivirus(復(fù)感染指數(shù)MOI為75),37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。每天倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長,通過觀察慢病毒上報告基因GFP的表達情況,評估感染效率。RNA干擾后第五天,通過觀察GFP評估細胞感染率約為70-80%,收集細胞,提取細胞總RNA,應(yīng)用Real time RT-PCR方法檢測不同實驗組中HIF-1α基因水平表達,Realtime RT-PCR數(shù)值分析采用標準曲線分析法。RNA干擾后第五天,收集細胞,提取細胞總蛋白,應(yīng)用Western-blot方法檢測不同實驗組中HIF-1α的蛋白表達水平。 4.以Tca8113細胞為研究對象,檢測HIF-1α沉默對CEACAM1、VEGF-C基因和蛋白水平表達的影響 Tca8113細胞培養(yǎng)并感染慢病毒顆粒,RNA干擾后第五天,通過觀察GFP評估細胞感染率約為70-80%,收集細胞,提取細胞總RNA,應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測不同實驗組中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C基因水平的表達,real time RT-PCR數(shù)值分析采用標準曲線分析法。RNA干擾后第五天,收集細胞,提取細胞總蛋白,應(yīng)用Western-blot方法檢測不同實驗組中HIF-1α的蛋白表達,再次驗證蛋白表達水平干擾效率。同時收集細胞,采用流式細胞術(shù)檢測CEACAM1的表達。RNA干擾后第五天收集Tca8113細胞培養(yǎng)液上清,采用ELISA方法對分泌至細胞外的VEGF-C蛋白進行檢測。分析三個不同實驗組中Tca8113細胞HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C在基因和蛋白水平表達情況,探討HIF-1α基因沉默后對CEACAM1和VEGF-C表達的影響。 5.建立HIF-1α基因沉默的口腔癌裸鼠移植瘤模型并觀察脈管生成及腫瘤進展 觀察口腔癌裸鼠移植瘤的增殖進展和荷瘤鼠生存情況,檢測移植瘤增殖活性及CEACAM1和VEGF-C表達情況,觀察腫瘤脈管生成情況及其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化情況,分析HIF-1α基因沉默與CEACAM1和VEGF-C表達及脈管生成的關(guān)系。 建立口腔癌裸鼠移植瘤模型：37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)Tca8113細胞,將生長狀態(tài)良好的細胞以4×104／孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2m1DMEM培養(yǎng)基。48小時后,細胞融合率可達到30-50%。將細胞分為空白對照組、陰性對照組和干擾組,分別加入ENi.S.、NC-GFP慢病毒顆粒和HIF-1 a-RNAi慢病毒載體(復(fù)感染指數(shù)MOI為75),37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。在細胞生長狀態(tài)良好時配制細胞懸液,細胞濃度為2×106個／ml,備用。5周齡的BALB/C nu/nu雌性裸鼠30只,(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所),分為空白對照組、陰性對照組和干擾組,每組10只,注射0.1ml空白對照組、陰性對照組和干擾組Tca8113細胞懸液(細胞數(shù)量為2×105個)于裸鼠背部皮下。接種腫瘤細胞后,將裸鼠置于SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),每天觀察裸鼠背部的成瘤情況并在成瘤后定期對腫瘤大小進行測量。 四周后每組裸鼠中的5只分別乙醚吸入麻醉后進行熒光實時活體成像,然后脫頸處死,收集腫瘤標本。將收集的裸鼠腫瘤標本進行常規(guī)處理制備成蠟塊,應(yīng)用免疫組化方法檢測三組裸鼠腫瘤標本中CEACAM1、VEGF-C、Ki67、LYVE-1(抗鼠)和CD31(抗鼠)的表達,并計數(shù)評估MVD和LVD,觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,免疫雙標記法檢測新生脈管內(nèi)皮細胞表型變化,研究HIF-1α基因沉默后對裸鼠移植瘤血管和淋巴管生成及其形態(tài)學(xué)改變和正�；挠绊憽� 6.觀察口腔癌裸鼠移植瘤模型生存情況 三組裸鼠每組剩余5只繼續(xù)在SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),觀察研究荷瘤鼠生存情況,并進行生存分析。 結(jié)果： 1.HIF-1α在口腔鱗狀細胞癌中高表達,并與CEACAM1和VEGF-C表達呈正相關(guān) HIF-1α在腫瘤中高表達(口腔癌陽性率95%,舌癌陽性率100%),細胞核和細胞漿著色；CEACAM1在腫瘤中表達增高(口腔癌中陽性率為83.5%,舌癌陽性率80%),胞膜和胞漿著色；VEGF-C在腫瘤中表達增高(舌癌陽性率為90%),胞膜胞漿著色。HIF-1α表達與CEACAM1和VEGF-C呈正相關(guān)(r=1.26, P0.05; r=1.45, P0.05) 2. CEACAM1表達模式與口腔癌分化密切相關(guān),并與腫瘤脈管生成和內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān) CEACAM1在口腔高分化鱗狀細胞癌中呈胞膜陽性表達,在中分化和低分口腔癌中呈胞漿陽性表達(P＜0.01)。在60例CEACAM1陽性的中分化和低分化癌中,有50例顯示胞漿呈中到高表達,染色范圍從33%到80%,與此形成鮮明對比的是在20例高分化癌中,16例顯示胞膜陽性表達。在CEACAM1陽性病例中,CEACAM1陽性的脈管數(shù)量較陰性病例中顯著增高(P＜0.001)；同時,CEACAM1陽性病例比CEACAM1陰性病例MVD和LVD都顯著增加(P＜0.05)；CEACAM1和LYVE-1免疫熒光雙標記顯示雙標記陽性脈管數(shù)量在CEACAM1陽性病例中數(shù)量增加(P＜0.001)；LYVE-1和CD31免疫組化雙標記陽性脈管在CEACAM1胞漿陽性表達病例中升高(P＜0.001)。 3.RNAi慢病毒干擾載體有效抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表達 Real time RT-PCR和western blot檢測Tca8113細胞系中HIF-1α干擾效率：RNA干擾基因沉默HIF-1α后,Tca8113細胞基因水平和蛋白水平HIF-1α表達均明顯降低(P＜0.05),基因水平表達下降80%,蛋白水平表達降低50%。 4.基因沉默HIF-1α后CEACAM1基因水平和蛋白水平表達下調(diào) Real time RT-PCR和FCM(流式細胞術(shù))分別檢測各組Tca8113細胞CEACAM1表達,干擾組較對照組CEACAM1在基因水平和蛋白水平表達均降低。FCM結(jié)果顯示CEACAM1蛋白在空白對照組、陰性對照組和干擾組表達率分別為10.30%、12.73%和5.49%(P＜0.05)。 5.基因沉默HIF-1α后VEGF-C基因水平和蛋白水平表達下調(diào) Real time RT-PCR和ELISA檢測各組Tca8113細胞VEGF-C基因水平和蛋白水平表達,ELISA結(jié)果顯示干擾組VEGF-C較對照組表達明顯降低與空白對照組(P=0.029)和陰性對照組(P=0.032)比較具有顯著差異性,表明HIF-1α基因沉默顯著下調(diào)VEGF-C表達。 6.HIF-1α基因沉默組口腔癌裸鼠移植瘤模型中CEACAM1和VEGF-C表達顯著下調(diào),脈管生成明顯減弱,形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯的正�；厔� 免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤模型中CEACAM1、VEGF-C表達及脈管生成情況：干擾組較空白對照組和陰性對照組CEACAM1表達明顯降低(P＜0.05),MVD和LVD明顯降低(P＜0.05),并且形態(tài)趨于正�；�,管壁完整,內(nèi)皮細胞連續(xù),管腔規(guī)則,直徑變小。干擾組與對照組相比,管腔直徑差異性顯著(P＜0.001)。LYVE-1和CD31雙標記陽性脈管在干擾組中顯著減少(P＜0.05)。結(jié)果表明腫瘤HIF-1α基因沉默后,脈管生成受到抑制,并且新生脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)趨于正常。 7.HIF-1α基因沉默降低口腔癌裸鼠移植瘤增殖活性,降低腫瘤生長速度,延長荷瘤裸鼠生存期 RNA干擾組及陰性載體對照組和空白對照組裸鼠移植瘤生長曲線顯示,干擾組移植瘤生長速度明顯減慢(P＜0.05),可能與HIF-1α沉默導(dǎo)致受HIF-1α調(diào)控的細胞增殖相關(guān)基因活性降低,使得腫瘤細胞增殖降低。干擾組移植瘤Ki-67表達明顯降低(P＜0.005),說明HIF-1α沉默導(dǎo)致細胞增殖活性減弱。 裸鼠生存曲線分析顯示：干擾組裸鼠生存時間較空白對照和陰性對照明顯延長(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.HIF-1α在人口腔鱗狀細胞癌中高表達,并且與CEACAM1和VEGF-C表達呈正相關(guān)。CEACAM1表達與腫瘤分化程度關(guān)系密切,并與腫瘤脈管生成相關(guān)。CEACAM1陽性病例中,血管和淋巴管生成顯著增高,內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化也更活躍,這表明在HIF-1α高表達口腔癌中,HIF-1α可能通過調(diào)控CEACAM1和VEGF-C的表達,促進腫瘤血管和淋巴管生成,并對腫瘤血管內(nèi)皮細胞和淋巴管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化具有重要作用。 2.體外實驗顯示HIF-1α基因沉默顯著抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表達,同時隨著HIF-1α表達降低,CEACAM1和VEGF-C在基因水平和蛋白水平表達均下調(diào)。這表明在人口腔癌中HIF-1α可以調(diào)控CEACAM1和VEGF-C表達,HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能在口腔癌脈管生成中具有重要作用。 3.體內(nèi)實驗顯示,HIF-1α基因沉默組口腔癌裸鼠移植瘤模型HIF-1α表達明顯降低,腫瘤血管和淋巴管生成被顯著抑制,并且脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯趨于正常,血管內(nèi)皮細胞和淋巴管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化也更趨穩(wěn)定,同時,干擾組移植瘤CEACAM1和VEGF-C表達都明顯下調(diào),表明RNA干擾基因沉默HIF-1α后,通過下調(diào)CEACAM1和VEGF-C表達抑制腫瘤血管和淋巴管生成,并介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的表型轉(zhuǎn)化,使腫瘤脈管系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常。HIF-1α基因沉默還顯著降低裸鼠移植瘤增殖活性和生長速度,延長荷瘤裸鼠生存期,這表明HIF-1α基因沉默導(dǎo)致受HIF-1α調(diào)控的細胞增殖相關(guān)基因活性降低,使得處于靜止期的腫瘤細胞比例增高,腫瘤增殖活性降低,延遲了腫瘤的異質(zhì)性進展過程,有利于荷瘤鼠生存期延長。此外,干擾組移植瘤新生脈管系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常也會使其功能在一定程度上趨于正常,趨于正�；拿}管系統(tǒng)形成的微環(huán)境抑制了腫瘤細胞在乏氧環(huán)境下的異質(zhì)性克隆篩選,也會延緩腫瘤的異質(zhì)化進程,也有利于荷瘤鼠生存期的延長。 4.HIF-1α沉默通過下調(diào)口腔癌CEACAM1和VEGF-C的表達抑制口腔癌血管和淋巴管生成,促進新生血管和淋巴管結(jié)構(gòu)功能的正�；�,并能有效抑制腫瘤增殖活性和生長速度,延長荷瘤鼠生存期,因此,HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能成為口腔癌治療中的有效聯(lián)合靶點。6國家自然科學(xué)基金資助項日(30572056)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.85
【圖文】：

圖1.HIF一la在癌旁正�？谇徊ぶ械捅磉_，胞核著色(A)，在口腔鱗狀細胞癌中高表達，胞核胞漿著色(B)。400x，DAB顯示表2.口腔鱗狀細胞癌cEAcAMI和HIF一1a表達與臨床資料的關(guān)系病例數(shù)CEACAM1HIF一la陰性陽性表達模式陽性陰911576胞膜胞漿86(95%)2650低中一高性別男63954654女28622422年齡三59歲36630232全60歲55946844腫瘤分期

圖2.cEACAMI在低分化口腔癌中呈胞漿表達(A)，在高分化癌中呈胞膜表達(B)在個別癌旁正�；砟[狀上皮棘細胞層以上呈胞膜表達(C)，浸潤到上皮內(nèi)的炎細胞也呈陽性表達。A，C640x，B，400x，DAB顯色圖3.CEACAMI陽性口腔癌中CEACAMI陽性脈管數(shù)量增多(A)，而CEACAMI陰性口腔癌中CEACAMI陽性脈管數(shù)量減少(B)。64Ox，DAB顯色

山東大學(xué)博士學(xué)位論文兮廠--.’萬.t.古“·~.‘幾.嗀棄?一入.似t’公心.:’t.二、、.一‘，;J.-試.，六，‘汀月、、、一赴沐:‘_氣’_‘.幾，嚴:‘，譽;歲圖2.cEACAMI在低分化口腔癌中呈胞漿表達(A)，在高分化癌中呈胞膜表達幾龍乞(B)在個別癌旁正�；砟[狀上皮棘細胞層以上呈胞膜表達(C)，浸潤到上皮內(nèi)的炎細胞也呈陽性表達。A，C640x，B，400x，DAB顯色

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳強,楊述華,葉樹楠,王銳英;RNA干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1α治療骨肉瘤的實驗研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

本文編號：2797337