【摘要】： 牙髓、根尖周炎癥是口腔內(nèi)科常見病,細(xì)菌則是牙髓、根尖周病的主要致病因素。根管治療術(shù)是通過根管預(yù)備、根管消毒和根管充填等步驟,殺滅感染細(xì)菌,消除來自根管的刺激源,利用根尖周組織血運豐富、修復(fù)再生能力強的特點,治療牙髓壞死或根尖周病的方法。其目標(biāo)是從根管開口到縮窄的根尖孔對整個根管進(jìn)行三維清潔、成形和封閉,以達(dá)到治愈患牙,保存并恢復(fù)其功能的作用。而根管系統(tǒng)本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜且與根尖周、牙周相通,雖然經(jīng)過機械和化學(xué)預(yù)備后,根管內(nèi)的細(xì)菌、壞死牙髓和根管內(nèi)壁的感染物,大部分已被清除,但是對于側(cè)壁牙本質(zhì)小管深部,側(cè)支根管和根尖周等,器械以及沖洗液不易到達(dá)的地方仍存在細(xì)菌、毒素等病原刺激物,所以根管清理后的滅菌消毒仍是不容忽視的。長期的臨床追蹤觀察和基礎(chǔ)研究形成了很多不同的根管消毒方法和消毒藥物,目前學(xué)者們正在試圖尋找一種較理想的根管消毒藥物。 β防御素-3作為一種內(nèi)源性抗菌肽,其快速、高效、廣譜的抗菌效能和較少產(chǎn)生耐藥性的特點,使得其在口腔醫(yī)學(xué)中的研究和應(yīng)用有著較大的發(fā)展空間和良好的發(fā)展前景,將其引入感染根管的治療領(lǐng)域,對根管內(nèi)的致病菌產(chǎn)生殺菌作用,將有可能大大提高和改善根管內(nèi)滅菌消毒的效果,達(dá)到治愈牙髓、根尖周病變的目的。本課題本著基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用并重的目的而展開,通過基因工程技術(shù)來獲得有活性的重組人防御素-3,并分析其抗菌能力,經(jīng)過感染根管的體外和動物體內(nèi)實驗進(jìn)一步研究rhBD-3在感染根管治療中的作用,以期為牙髓和根尖周感染,尤其是根管內(nèi)的重度感染的治療尋找一條新的途徑。 所進(jìn)行的研究及結(jié)果如下: 第一部分hBD3基因的克隆和序列測定 本研究根據(jù)在GenBank中登錄的hBD3的完整的cDNA序列,設(shè)計一對引物,以臨床獲取的正常人新鮮牙齦組織的mRNA為模板,采用RT-PCR的方法獲得了hBD3成熟肽編碼區(qū)全長序列,將其克隆入pGEM-T-EASY載體,在大腸桿菌中進(jìn)行擴增,并進(jìn)行了序列測定。結(jié)果表明,我們所獲得的序列與Harder等文獻(xiàn)報道的序列完全一致,未發(fā)現(xiàn)有堿基的缺失或突變。 第二部分hBD3在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測 將hBD3成熟肽基因成功地正向克隆入pET-32a載體,構(gòu)建融合表達(dá)載體。將含有pET-32a-hBD3重組質(zhì)粒的BL21菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE顯示在約24KD處看到預(yù)期的條帶。Western blot結(jié)果也提示HIS融合蛋白有基礎(chǔ)性表達(dá)。對不同誘導(dǎo)時間、溫度、IPTG濃度時融合蛋白表達(dá)率分析的結(jié)果表明:hBD3在35℃、0.6mmol/L IPTG、誘導(dǎo)6小時表達(dá)量分別達(dá)高峰。表達(dá)的融合蛋白大部分以包涵體形式存在于沉淀中,小部分以可溶性形式存在于上清中。包涵體溶解物過Ni-NTA柱親和層析純化,經(jīng)洗脫液洗脫收集得到目的蛋白,然后經(jīng)多步透析法復(fù)性后,再進(jìn)行離子交換層析和凝膠柱脫鹽、濃縮。以SDS-PAGE檢測,純化蛋白為單一條帶。腸激酶可以對融合蛋白進(jìn)行切割,rhBD3從融合蛋白形式中分離出來,大小約5.1KD,與理論值接近。rhBD3的生物學(xué)活性分析實驗顯示rhBD3融合蛋白和融合蛋白酶切后的rhBD3成熟肽對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯抑菌環(huán)出現(xiàn),表示均有抗菌活性。 第三部分重組hBD3對染根管致病菌抗菌活性的體外研究 重組hBD3對感染根管各種致病菌的抗菌活性檢測結(jié)果顯示,rhBD3對所有試驗菌株均有抑制和殺滅作用,隨著rhBD3的濃度增加,細(xì)菌數(shù)量減少,與天然提取的hBD3活性基本一致。但是MIC或MBC濃度對不同的細(xì)菌而言并不一致。rhBD3除了對常見兼性厭氧的金黃色葡萄球菌,大腸桿菌有作用以外,對根管內(nèi)常見的專性厭氧菌的三種標(biāo)準(zhǔn)株有較好的抑制作用,而且對內(nèi)氏放線菌、白色念珠菌、糞腸球菌也有作用,對變形鏈球菌的抑制作用則比較小。 從重組hBD3對離體人牙根管內(nèi)致病菌抗菌活性研究的結(jié)果分析可以看出,封藥后細(xì)菌陽性的根管數(shù)量明顯低于封藥前,其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.005),說明四種消毒藥物包括rhBD3對根管內(nèi)的優(yōu)勢致病菌均有抗菌或抑菌作用;對比四種消毒藥物對各種細(xì)菌的抗菌活性發(fā)現(xiàn),其中FC組、碘仿糊劑組和rhBD3組的抗菌活性高于Ca(OH)2糊劑組(P0.05),特別是對于厭氧菌;但是FC組、碘仿糊劑組和rhBD3組間的抗菌活性則無明顯區(qū)別(P0.05)。 第四部分重組hBD3對犬的感染根管內(nèi)致病菌抗菌活性的體內(nèi)研究 本實驗建立了犬的感染根管動物模型,攝X線片證實各實驗犬牙出現(xiàn)不同程度的牙周膜腔增寬、根尖周骨質(zhì)稀疏區(qū)。實驗中各處理組在根管封藥后,無論厭氧還是需氧菌,細(xì)菌的檢出率明顯減少,經(jīng)x2檢驗,消毒前、后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.005)。進(jìn)一步兩兩比較,Fc組,Ca(OH)2糊劑組,rhBD3組均與空白對照組有顯著差別(P0.05),前三者的細(xì)菌檢出數(shù)值遠(yuǎn)小于后者,說明Fc,Ca(OH)2糊劑,rhBD3對根管內(nèi)的需氧和厭氧菌均有抑制作用,都能顯著減少預(yù)備后根管內(nèi)的細(xì)菌。以上結(jié)果證實了rhBD3在感染根管內(nèi)的抑菌效果。另外Fc組、rhBD3組與Ca(OH)2糊劑組也有顯著性差別(P0.05),從數(shù)值上看,前兩者的效果好于后者。經(jīng)x2檢驗,,rhBD3組對需氧和厭氧菌消毒前后的差異均具有極顯著性(P0.005),說明消毒效果都非常好,而對需氧和厭氧菌2個菌種之間的消毒差異無顯著性(P0.05)。 切片觀察封藥后各組實驗牙根尖周組織炎癥分級情況,空白對照組與3個藥物處理組有統(tǒng)計學(xué)差別(P0.05),說明每個藥物處理組對根尖周炎癥均有一定影響。Fc組與Ca(OH)2糊劑組相比有顯著性差別(P 0.05),從結(jié)果來看,Fc組的根尖周組織炎癥程度重于Ca(OH)2糊劑組,提示Fc組對根尖周炎癥的作用不理想,這可能與其本身的強刺激性有關(guān)。而rhBD3組與Ca(OH)2糊劑組相比也有顯著性差別,這或許與β-防御素具有間接的免疫激活作用有關(guān)。 綜上所述,根管系統(tǒng)的復(fù)雜性和感染細(xì)菌的多樣性,決定了根管滅菌消毒的必要性。根管預(yù)備完成后,在根管內(nèi)封入適當(dāng)?shù)乃幬?可以進(jìn)一步控制微生物,防止再感染,從而鞏固和加強根管預(yù)備的效果。根據(jù)以往對β防御素的研究結(jié)果結(jié)合以上我們的實驗,提示rhBD3用于感染根管內(nèi)的殺菌消毒,具有一定的臨床可行性,有很好的應(yīng)用前景,其具體的多方面的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的實驗研究。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R781.3
【圖文】：

圖1 β-defensins 氨基酸序列及其二硫鍵位置1.3.2.3 生物學(xué)活性1） 抗微生物活性及其作用機理β-防御素具有廣譜的抗菌活性。在體外，hBD1 在毫摩爾濃度下對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、螺旋體、分枝桿菌及有包膜病毒均具有殺滅作用。重組的hBD1其抗微生物活性不受低pH值的影響，但受高鹽環(huán)境抑制。研究表明，hBD1在肺部感染性疾病，如肺纖維化病中發(fā)揮重要的作用[41]。hBD2對革蘭氏陰性菌有高效的殺菌作用，在約10μg/ml的濃度下就可以達(dá)到90%的殺菌效果（LD90）；對酵母也具有有效的殺傷作用，LD90為25μg/ml；而對革蘭氏陽性菌則hBD2的濃度要達(dá)到100μg/ml時才有抑菌作用。故hBD2對革蘭氏陰性菌的殺傷作用強于對革蘭氏陽性菌的作用[42,43]。hBD3與hBD1和hBD2一樣具有抗菌活性，尤其對革蘭氏陽性菌具

3.4 測序結(jié)果PCR產(chǎn)物序列如圖5測序結(jié)果經(jīng)序列同源性分析證明，所獲得的PCR產(chǎn)物為預(yù)期的hBD3序列，與文獻(xiàn)報道結(jié)果完全一致，序列覆蓋hBD3成熟肽編碼區(qū)全長（圖6）。

測序結(jié)果序列同源性分析4.討論

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