【摘要】：目的純化的人顱骨成骨細(xì)胞為陽性靶細(xì)胞,以牙齦成纖維細(xì)胞為吸附對照細(xì)胞從噬菌體十二肽庫中篩選出能與之特異性結(jié)合的多肽,即為成骨細(xì)胞特異性識別多肽,其氨基酸序列為:VLAVPWSEPGYL。本研究意在探討該多肽對人顱骨成骨細(xì)胞黏附及遷移作用的影響,并確定該多肽體外促進人顱骨成骨細(xì)胞遷移及黏附的最佳濃度,為該多肽的進一步研究提供實驗基礎(chǔ)。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:1.細(xì)胞黏附實驗檢測特異性識別多肽對人顱骨成骨細(xì)胞黏附作用的影響體外常規(guī)培養(yǎng)人成骨細(xì)胞,用條件培養(yǎng)液分別稀釋成骨細(xì)胞特異性識別多肽,使其濃度分別為 10-4mol/L 組、10-5mol/L 組、10-6mol/L 組、10-7mol/L 組、10-8mol/L組,及空白對照組。分別于相應(yīng)時間點(0.5h,1h,2h,4h,8h)吸棄培養(yǎng)基,采取體視學(xué)的方式,顯微鏡下計算隨機視野內(nèi)黏附的細(xì)胞數(shù)。每組計算6個視野區(qū),統(tǒng)計每組的平均值(細(xì)胞數(shù)/mm2)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:在此濃度范圍內(nèi),成骨細(xì)胞特異性識別多肽對人顱骨成骨細(xì)胞黏附具有一定促進作用,其最佳有效作用濃度是10-5mol/L(P0.05)。2.細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗及Transwell遷移實驗檢測成骨細(xì)胞特異性識別多肽對人成骨細(xì)胞遷移作用的影響2.1.細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗體外常規(guī)培養(yǎng)人顱骨成骨細(xì)胞,不含多肽的無血清培養(yǎng)基作為對照組,實驗組分為10-4、10-5、10-6 10-7、10-8mol/L五個多肽濃度組。用消毒的2ul槍頭在鋪滿單層細(xì)胞的六孔板底表面緩慢輕柔地劃出一條筆直痕跡,分別在0,24,48小時拍照觀察細(xì)胞的相對劃痕愈合面積(=遷移前劃痕的面積-遷移后劃痕的面積),以24小時劃痕愈合面積作為統(tǒng)計學(xué)計算標(biāo)準(zhǔn)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:實驗組各濃度組與對照組之間24h劃痕愈合面積的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=75.87,P0.05),與對照組及其余實驗組相比,10-4mol/l與10-5mol/l組細(xì)胞劃痕愈合面積均顯著增加(P0.05)2.2Transwell遷移實驗體外培養(yǎng)人顱骨成骨細(xì)胞,實驗分為六組,即空白對照組、10-4mol/L組、10-5mol/L 組、10-6mol/L 組、10-7mol/L 組、10-8mol/L 組。采用 transwell 小室(24孔,孔徑8.0um,聚碳酸酯膜厚度6.5mm),上室加入1×105個/ml含1%血清的細(xì)胞懸液100ul,下室按照實驗分組加入含不同濃度多肽的含30%血清培養(yǎng)液600ul,空白對照組加入不含多肽的含30%血清培養(yǎng)液600ul,72h后取出小室,對遷移至膜下細(xì)胞進行固定、染色、拍照、計數(shù),統(tǒng)計學(xué)分析所獲得的實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果:實驗組各組細(xì)胞遷移數(shù)目均高于對照組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=127.999,P0.05)。10-4mol/l 與 10-6mol/l 濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.25,P0.05)。綜上,一定濃度范圍的特異性識別多肽可促進成骨細(xì)胞的黏附與遷移,且10-5mol/l濃度的促進作用最為顯著。3.Transwell遷移實驗檢測特異性識別多肽對人牙齦成纖維細(xì)胞及人骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移作用的影響。體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞及人骨髓基質(zhì)細(xì)胞,實驗分為六組,即空白對照組、10-4mol/L 組、10-5mol/L 組、10-6mol/L 組、10-7mol/L 組、10-8mol/L 組。采用transwell小室(24孔,孔徑8.0um,聚碳酸酯膜厚度6.5mm),上室加入1×105個/ml含1%血清的細(xì)胞懸液100ul,下室按照實驗分組加入含不同濃度多肽的含10%血清培養(yǎng)液600ul,空白對照組加入不含多肽的含10%血清培養(yǎng)液600ul,24h后取出小室,對遷移至膜下細(xì)胞進行固定、染色、拍照、計數(shù),獲得的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:在此濃度范圍內(nèi),成骨細(xì)胞特異性識別多肽對人牙齦成纖維細(xì)胞遷移具有一定抑制作用,對人骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移具有一定的促進作用。結(jié)論成骨細(xì)胞特異性識別多肽能夠促進成骨細(xì)胞黏附及遷移。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R783
【圖文】：

培養(yǎng)液渾濁可見相當(dāng)一部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，未貼壁生長，細(xì)胞貼壁逡逑生長率約６０％。培養(yǎng)２４－４８ｈ后倒置顯微鏡觀察，可見細(xì)胞伸展，恢復(fù)梭形或紡錘逡逑形正常外觀，細(xì)胞較小，胞突較短，有數(shù)目不等、長短不同的胞質(zhì)突，見圖２Ａ。逡逑培養(yǎng)３－４天后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形或紡錘形，有多個較長的細(xì)胞突起逡逑（２－４個），胞漿豐滿、均勻，核呈卵圓形或圓形，有１－３個核仁，核仁清晰可見，逡逑見圖２Ｂ。逡逑？邋．邋？邋＇邋．邋■邋．逡逑八，邐■邐－逡逑■＇邋－ｖ：－邋■；邋■＇邋■逡逑■逡逑NB．．邋ｍ二邐＇邋＇＾：逡逑；Ａ邐Ｂ逡逑？…．、：、二＇Ｋ．．邐■逡逑，．邐Ｖ．、，、邐，邐■邐１邋１邐，逡逑圖２倒置顯微鏡下觀察人牙齦成纖維細(xì)胞形態(tài)逡逑Ａ：邋ｘ４0；邋Ｂ：邋ｘ４0逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＣＧ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｐｈａｓｅ邋ｃｏｎｔｒａｓｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．逡逑Ａ：邋ｘ４0；邋Ｂ：ｘ４0逡逑３．邋１．３．體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察逡逑人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞購回當(dāng)天

培養(yǎng)液渾濁可見相當(dāng)一部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，未貼壁生長，細(xì)胞貼逡逑壁生長率約７０％。４８小時觀察細(xì)胞伸展恢復(fù)梭形外形，細(xì)胞貼壁增加，仍有少許逡逑細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液屮，見圖３邋Ａ。３天換液后倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)逡逑皿底上，細(xì)胞形態(tài)成梭形、角狀，細(xì)胞生長力旺盛，密集分布，見圖３Ｂ。逡逑２０逡逑

３．邋２不同濃度成骨細(xì)胞特異性識別多肽的配制逡逑課題組采用的成骨細(xì)胞特異性識別多肽，要求純度達(dá)到９８％以上，由生產(chǎn)方（上逡逑�？齐纳锟萍加邢薰荆┦褂茫龋校蹋煤唾|(zhì)譜進行鑒定，見圖４。該多肽按２０ｍｇ每逡逑瓶進行分裝，離心后以無水乙醇溶解后，溶液澄清透明。無水乙醇多肽溶液融入逡逑含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培養(yǎng)液中，充分吹散混勻至培養(yǎng)液內(nèi)無結(jié)晶物質(zhì)。逡逑ｎＶ逡逑－、…逡逑１８００邐Ｉ逡逑�。迹ぃ埃板义希保矗埃板义希保玻埃板义希保茫希襄义希福埃板义希簦铮镥义希剩希襄义希玻海哼姡桑�§逡逑ｔ邐ＪＵ邐邐邋．．．ｊ邐逡逑＾＾邐ｊｉ邐ｓ邐邐ＩＡ邐ｌｉＳ邐ＬＡ邐ｇａｉｎ逡逑圖４邋ＶＬＡＶＰＷＳＥＰＧＹＬ質(zhì)譜分析報告逡逑Ｆｉｇ４邋Ｔｈｅ邋ｍａｓｓ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｐｏｒｔ邋ｏｆ邋ＶＬＡＶＰＷＳＥＰＧＹ逡逑２１逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2790677