【摘要】： 背景：口腔念珠菌病是由念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病。近年來,隨著廣譜抗生素、細胞毒性藥物及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,艾滋病、糖尿病、惡性腫瘤患者的增多,器官移植術(shù)及導(dǎo)管介入等各種治療手段的開展,宿主的免疫功能低下或發(fā)生菌群失調(diào),使得口腔念珠菌病的發(fā)病率迅速上升。盡管白色念珠菌是主要的條件致病性真菌,但毒力較弱的菌種如克柔念珠菌的感染也在免疫力低下的患者中頻頻發(fā)生。口腔念珠菌病的發(fā)病機制受到很多因素影響,不僅與念珠菌菌體本身的形態(tài),菌體表面結(jié)構(gòu)及黏附力有關(guān),還與宿主的免疫防御機制有關(guān)。白色念珠菌黏附于宿主上皮是其在宿主中形成集落及入侵體內(nèi)的第一步,也是念珠菌具有強致病性的標(biāo)志。白細胞介素-8(IL-8)是中性粒細胞強有力的趨化因子,在免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中發(fā)揮雙重作用。大量國內(nèi)外研究表明在口腔念珠菌病中,白色念珠菌可以激發(fā)口腔黏膜上皮細胞產(chǎn)生IL-8等細胞因子,參與黏膜局部防御反應(yīng)。然而有關(guān)克柔念珠菌對口腔黏膜上皮細胞黏附作用的研究并不多見,克柔念珠菌單獨及與白色念珠菌混合感染后口腔黏膜上皮細胞表達IL-8參與口腔黏膜防御反應(yīng)的研究國內(nèi)還未見報道。 目的：本實驗通過克柔念珠菌與口腔黏膜上皮細胞的共同培養(yǎng),探討克柔念珠菌對口腔黏膜上皮細胞的黏附作用。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)從mRNA和蛋白水平上觀察克柔念珠菌單獨及與白色念珠菌混合感染對口腔黏膜上皮細胞(KB細胞)表達IL-8的影響,初步探討IL-8在口腔黏膜上皮細胞防御克柔念珠菌感染中的可能作用。 方法：1.在體外將克柔念珠菌與KB細胞共同培養(yǎng),以白色念珠菌與KB細胞的黏附作為對照組,黏附后的細胞爬片經(jīng)革蘭染色,倒置顯微鏡下計數(shù)100個上皮細胞上黏附的念珠菌數(shù)。胰酶消化后收集細胞及念珠菌,臺盼藍排斥實驗檢測念珠菌的總數(shù)及菌絲轉(zhuǎn)換率。2.將克柔念珠菌的孢子相和菌絲相菌懸液及與白色念珠菌混合后的孢子相和菌絲相菌懸液分別與KB細胞共同培養(yǎng),以單獨培養(yǎng)的KB細胞作為對照組,于6、12、24、48小時提取培養(yǎng)上清液,酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測上清液中IL-8的蛋白含量。3.用Trizol法提取共同培養(yǎng)24小時后的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-8的mRNA水平。實驗數(shù)據(jù)間差異進行t檢驗,判斷其統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1.克柔念珠菌黏附于KB細胞有時間依賴性,在24小時內(nèi)隨著時間的延長,黏附數(shù)逐漸增多,與對照組白色念珠菌比較,克柔念珠菌的黏附數(shù)低于白色念珠菌；克柔念珠菌黏附KB細胞后,其形態(tài)從孢子相向菌絲相的轉(zhuǎn)變也有時間依賴性,在24小時內(nèi)隨時間的延長,菌絲轉(zhuǎn)換率逐漸增高,但克柔念珠菌的總數(shù)卻減少。2.KB細胞基礎(chǔ)表達少量的IL-8蛋白,在克柔念珠菌單獨及與白色念珠菌混合感染KB細胞后表達IL-8的蛋白水平均高于對照組；克柔念珠菌菌絲相單獨及與白色念珠菌菌絲相混合感染KB細胞后表達IL-8的蛋白水平高于孢子相；培養(yǎng)上清液中IL-8的表達隨時間的延長而逐漸增加,24小時達到高峰,隨后出現(xiàn)下降趨勢；克柔念珠菌感染KB細胞后表達IL-8的蛋白水平,無論是孢子相還是菌絲相,均高于克柔念珠菌和白色念珠菌的混合感染。3.克柔念珠菌單獨及與白色念珠菌混合感染KB細胞24小時后,表達IL-8mRNA的水平均高于對照組；克柔念珠菌菌絲相單獨及與白色念珠菌菌絲相混合感染KB細胞后表達IL-8mRNA的水平高于孢子相；克柔念珠菌的孢子相及菌絲相感染KB細胞后表達IL-8mRNA的水平均高于克柔念珠菌與白色念珠菌混合的孢子相及菌絲相。 結(jié)論:1.克柔念珠菌對口腔上皮細胞的黏附作用有時間依賴性,克柔念珠菌對宿主細胞的黏附能力弱于白色念珠菌。2.克柔念珠菌形態(tài)從孢子向菌絲的轉(zhuǎn)換可以幫助念珠菌逃避宿主的防御反應(yīng),與致病性有一定的關(guān)系。3.克柔念珠菌在mRNA和蛋白水平上能增強口腔上皮細胞表達IL-8,提示IL-8可能與局部克柔念珠菌感染的防御反應(yīng)相關(guān)。4.克柔念珠菌與白色念珠菌混合感染時表達IL-8的含量低于克柔念珠菌單獨感染,提示克柔念珠菌與白色念珠菌之間可能存在相互拮抗作用。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R781.52
【圖文】：

(一)、克柔念珠菌與KB細胞的乳附結(jié)果(見圖l):克柔念珠菌與KB細胞的豁附有時間依賴性，在24小時內(nèi)隨著時間的延長，勃附數(shù)逐漸增多。與對照組白色念珠菌比較，克柔念珠菌的豁附數(shù)低于白色念珠菌，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

注:克柔代表克柔念珠菌，白念代表白色念珠菌(以‘卜同此)圖2.克柔念珠菌的總數(shù)及菌絲轉(zhuǎn)換率的結(jié)果Fig2.ThetotalnumberofCandidaKruseiandresultofthetransformationofhyPhaeform二、IL一8蛋白含量的檢測結(jié)果(見表1，圖3)1.KB細胞基礎(chǔ)表達少量的IL一8蛋白，在克柔念珠菌單獨及與白色念珠菌混合感染KB細胞后表達IL一8的蛋白水平均高于對照組，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.克柔念珠菌的菌絲相感染KB細胞后表達IL一8的蛋白水平與抱子相比較無差異，P>0.05;克柔念珠菌與白色念珠菌的菌絲相棍合感染KB細胞后表達IL一8的蛋白水平高于抱子相混合感染，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.抱子相和菌絲相克柔念珠菌單獨及與白色念珠菌混合感染KB細胞后表達IL一8的蛋白水平有時間依賴性，隨時間的延長，表達逐漸增加，24小時達到高峰，隨后略有降低。

表1.IL一8蛋白含量的檢測結(jié)果(p留ml，肚s)Tab1.TheresultofIL一8proteinlevels(p留ml，壯s)實驗組對照克柔抱子相克柔菌絲相克柔+白念抱子相克柔+白念菌絲相16.391士023.038士1.65932.813士1.10627.730士1.65935.550土0.55363.310士2.212104.363士6.08272.693士5.52947.670士1‘10675.43肚7.188119.611士9.95382.468土2.76529.294士0.55330.858士1.65949.234士1.工0641.805土0.55337.505士1.10649.234士16.58864.483士1.65951.58士1.186

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本文編號：2785283