【摘要】： 干細胞(stem cell)是一種具有多向分化潛能和自我復制功能的未分化細胞，在特定的條件下，可以分化為不同的功能細胞，形成多種組織和器官。胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)的分化和增殖構(gòu)成個體發(fā)育的基礎(chǔ)；而成體干細胞(adult stem cell，AS)的進一步分化則是成體組織、器官修復再生的基礎(chǔ)。研究干細胞一方面可以揭示許多有關(guān)生長發(fā)育的基礎(chǔ)理論難題，另一方面則可用于臨床治療—細胞移植治療各種疾病和構(gòu)建人工組織或器官。體外定向分化是干細胞研究和應(yīng)用的關(guān)鍵，也是生命科學領(lǐng)域的世界性難題。 起源于顱神經(jīng)嵴的面突外胚間充質(zhì)干細胞(ecto-mesenchymal stem cell，EMSC)是胚胎頜面發(fā)育過程中的暫時性結(jié)構(gòu)，具有向多種細胞分化的潛能，可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、牙乳頭細胞、雪旺氏細胞、聽神經(jīng)節(jié)等，并將形成上下頜骨、顳下頜關(guān)節(jié)軟骨、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙周膜等組織器官，是多能干細胞。作為頜面部多種組織的前體細胞，外胚間充質(zhì)干細胞在頜面部發(fā)育和分化研究中占有重要的地位，并可為組織工程提供可靠的細胞來源，為臨床應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。 目前，對外胚間充質(zhì)干細胞的前體細胞—顱神經(jīng)嵴細胞進行了定向誘導分化。初步認為，GGF、TGFβs、BMPs等生長因子在體外可影響神經(jīng)嵴細胞的最終分化。其中BMP-2／4可誘導其分化為神經(jīng)元，GGF可誘導其分化為雪旺細胞，TGF-β1、2、3可誘導其分化為平滑肌細胞。因此，在體外用各種生長因子進行誘導，外胚間充質(zhì)干細胞是有可能分化為頜面部發(fā)育所需的大部分細胞的。 正常體細胞經(jīng)過有限的分裂后，會出現(xiàn)衰老、死亡。而永生化細胞具有無限增殖能力。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是目前最安全、可靠的永生化基因。利用hTERT永生化面突外胚間充質(zhì)干細胞，可 第四軍醫(yī)大學博土學位論文 以克服有限的細胞來源，為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供充足、可靠的細胞來源。 本實驗旨在探討人早期胚胎面突外胚間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能，并對該 細胞永生化進行了初步研究，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 一、胚胎面突外胚間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定 50天流產(chǎn)自愿捐贈的胚胎，酶消化法培養(yǎng)面突外胚間充質(zhì)干細胞，白血病抑 制因子抑制分化。免疫細胞化學法染色顯示，細胞表達遷移中神經(jīng)峭細胞特異的 HNK－l；Vmentin強陽性表達，顯示其間充質(zhì)特性；Vlll因于弱表達；細胞不表達 NF、GFAP、a．SMA、CK。結(jié)果表明，所獲得的細胞為未分化的外胚間充質(zhì)干細 胞，為進一步研究其分化特性奠定了基礎(chǔ)。 二、外胚間充質(zhì)干細胞的自發(fā)分化 自發(fā)分化包括體內(nèi)及體外研究。 將培養(yǎng)的未分化外胚間充質(zhì)干細胞注入裸鼠皮下，l 周時部分細胞出現(xiàn)壞死 吸收，2周時無法找到注射的細胞，不排除細胞局部同化現(xiàn)象。 在體外，去除白血病抑制因子后2天，外胚間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)明顯向平滑肌 細胞分化的現(xiàn)象，約的％的細胞表達平滑肌細胞特異性標志a－SMA。二周，約有 1％的細胞表達神經(jīng)纖維細絲蛋白 NF，零星細胞表達神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 GFAP，同時細胞表達1型膠原。表明外胚間充質(zhì)干細胞有分化能力，自發(fā)分化呈 現(xiàn)向平滑肌細胞優(yōu)勢分化的傾向。 三、外胚間充質(zhì)干細胞向平滑肌細胞、成骨細胞的誘導分化 利用生長因子法誘導外胚間充質(zhì)干細胞在體外分化。 免疫細胞化學法圖象分析及半定量PCR顯示，TGF－日能有效促進EMSC向 平滑肌細胞分化，平滑肌細胞比例由自發(fā)分化的65％增加到近95％。 在含p－甘油磷酸鈉、維生素乙地塞米松的礦化液中，EMSC被誘導分化為 成骨細胞，堿性磷酸酶活性增強，I型膠原染色陽性，能形成礦化結(jié)節(jié)，細胞表達 成骨細胞特異的骨鈣素。 －4－ 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 四、外胚間充質(zhì)干細胞向成牙本質(zhì)樣細胞的誘導分化 在轉(zhuǎn)化生長因于pl 和牙本質(zhì)非膠原蛋白的作用下，細胞在膠原三維培養(yǎng)體 系中呈現(xiàn)成牙本質(zhì)細胞特異的形態(tài)改變，細胞出現(xiàn)極化，胞核位于一側(cè)，另一側(cè) 有很長的突起，細胞平行排列；表達牙本質(zhì)特異的涎磷蛋白（DSPP）；在礦化液中， 誘導細胞能形成礦化結(jié)節(jié)；在體內(nèi)，含細胞的膠原也出現(xiàn)礦化趨勢。表明EMSC 己 被成功誘導分化為終末期的成牙本質(zhì)樣細胞。 誘導分化實驗表明，外胚間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，在體外能被誘導 分化為多種有功能的終末分化細胞。 五、外胚間充質(zhì)干細胞的永生化 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將編碼hTERT和 neo基因的真核表達載體PCIneo山TERT 導入外胚間充質(zhì)干細胞。＊418加壓篩選后，獲3個抗性克隆。免疫細胞化學法檢 測顯示，細胞hTERT活性得以重建，衰老現(xiàn)象得以逆轉(zhuǎn)。增殖能力變強�？寺�2 來源的細胞在體外長期培養(yǎng)生長良好，至今己 5個月、49代，越過 MI期，命名 為（hTERTEMSC－2）。該細胞核型正常、在軟瓊脂內(nèi)不能生長、無裸鼠致瘤性。 表明轉(zhuǎn)染的細胞是hTERT介導的永生化細胞，?
【學位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 傅文玉,路艷蒙,樸英杰;人骨髓間充質(zhì)干細胞的分化與端粒酶活性[J];第一軍醫(yī)大學學報;2001年11期

2 王林;研究與開發(fā)人體干細胞[J];全球科技經(jīng)濟w

本文編號：2749088