【摘要】： 實體瘤的生長依賴腫瘤血管，從周圍已存在的血管中經過芽生形成新的血管謂之血管生成。血管生成素(Angiopoietins，Angs)是近年來發(fā)現的繼內皮細胞生長因子和酪氨酸激酶受體(VEGF／KDR)之后的另一類與血管生成密切相關的一大家族，不僅在胚胎血管發(fā)育和多種生理狀態(tài)下的血管生成中發(fā)揮調節(jié)作用，還與腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下的血管生成密切相關，但其效應和作用機制尚在不斷的探索之中。 血管生成素家族是一個既含受體激動劑又含受體抑制劑的促血管生成家族，現已發(fā)現4個成員：Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4，均能識別內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體Tie-2，但效應截然不同。Ang-1通過激活Tie-2，起到穩(wěn)定血管，維持血管壁完整性和調節(jié)血管功能的作用。Ang-2則通過抑制Tie-2的磷酸化，離斷血管內皮細胞與周細胞的結合，破壞血管穩(wěn)定性，從而參與血管重塑和內膜去穩(wěn)定作用，與腫瘤新生血管的生成密切相關。 目前已檢測到Ang-2在多種腫瘤組織中表達增高，如：胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌、膠質瘤、前列腺癌，卵巢癌等，且其表達強度與腫瘤血管形成的數目，臨床分期、淋巴結轉移、預后相關。有人用Ang-2轉基因的胃癌細胞和結腸癌細胞建立動物實驗模型，結果表明Ang-2的高表達能促進腫瘤的生長、轉移，目前多數實驗均支持這一結果；但也有人用Ang-2轉基因的Lewis肺癌及TAS乳癌細胞接種小鼠，發(fā)現Ang-2的高表達能促進血管內皮細胞和腫瘤細胞凋亡，破壞腫瘤血管的完整性，從而抑制腫瘤的生長、轉移，這說明Ang-2在不同的腫瘤組織中所起效應不一樣。最新觀點認為，Ang-2在腫瘤形成中有促血管退化和啟動血管新生的雙重作用，特別是與血管內皮細胞生長因子(VEGF)的存在與否密切相關。其具體效應怎樣?可能與哪些機制有關?在其作用過程中和其它促、抑血管生成因子間的相互作用如何?這些均需進一步探索。 口腔頜面部腫瘤血供豐富，早期易于血道、淋巴道轉移，綜合國內、外文獻，Ang-2在口腔頜面部腫瘤生長、轉移中的作用罕見報道，本課題將檢測Ang-2在口腔頜面部鱗癌組織中的表達，分析其表達強度與臨床生物學行為的關系，并建立Ang-2轉基因的Tca8113舌鱗癌裸鼠移植瘤模型，以進一步探討Ang-2在口腔鱗癌生長中的作用，及其與VEGF、基質金屬蛋白酶、一氧化氮等其它促血管生長因子之間的關系。 第一部分血管生成素2在口腔頜面部鱗癌中的表達及意義 一、研究目的 檢測Ang-2在口腔頜面部鱗癌中的表達，并分析其表達強度與淋巴結轉移、腫瘤分期等臨床生物學行為的關系，以初步了解Ang-2在口腔頜面部惡性腫瘤生長中的作用。 二、材料方法 1．組織標本 選取2003．5——2006．5浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院口腔外科手術切除的口腔頜面部鱗癌組織及癌旁無瘤組織。 2．方法 (1)實時熒光定量法檢測Ang-2 mRNA，VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達。 (2)免疫組化半定量法檢測Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達。 三、結果 1．Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達 Ang-2 mRNA，VEGF mRNA在癌組織中的表達為6.86±1.37、9.36±2.75，在癌旁無瘤組織中的表達為7.95±2.08、11.03±2.67，差異有顯著意義(P＜0.05)。 2．Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達 Ang-2、VEGF陽性染色定位于腫瘤細胞和血管內皮細胞的胞漿和胞膜中，腫瘤組織中的Ang-2、VEGF蛋白合成明顯活躍，半定量計分法提示Ang-2、VEGF蛋白在腫瘤組織中的陽性表達率為53.57％、60.71％；在癌旁無瘤組織中的陽性表達率為24.00％、28.00％，差異有顯著意義(P＜0.05) 3．Ang-2表達強度與口腔頜面部鱗癌臨床生物學行為的關系 Ang-2 mRNA在淋巴結轉移陰性和陽性組的表達分別為7.07±1.50、6.60±1.21；在Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ的不同臨床分期組的表達分別為7.17±1.58、6.59±1.14，差異均無顯著意義(P＞0.05)。 四、結論 1．Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達高于癌旁無瘤組織。 2．Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達高于癌旁無瘤組織，兩者不僅定位于血管內皮細胞，也定位于腫瘤細胞的胞漿和胞膜中，提示共同參與了口腔頜面部腫瘤血管的形成。 3．Ang-2的表達強度與淋巴結轉移及臨床分期無明顯相關性，這一點需要更大的樣本量進一步研證。 第二部分血管生成素2對舌鱗癌裸鼠移植瘤的成瘤影響 一、研究目的 為進一步探討Ang-2在口腔頜面部腫瘤中的成瘤效應，本實驗旨在構建Ang-2轉基因的Tca8113舌鱗癌細胞系，觀察Ang-2對舌鱗癌裸鼠體內成瘤的影響。 二、研究方法 1．實驗動物、細胞和主要試劑 (1)裸鼠：6周齡健康雌性BALB／C裸鼠27只，分三組。 (2)細胞株：人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113，購自上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院口腔生物研究所。 (3)克隆質粒pBLAST49-hANGPT-2：購于Invivogen公司。 2．方法 (1)構建pcDNA3.1(-)B／Ang-2重組表達質粒。 (2)脂質體轉染法：pcDNA3.1(-)B／Ang-2導入Tca8113細胞系，G418篩選穩(wěn)轉Ang-2基因的Tca8113細胞，并以RT-PCR及qRT-PCR法檢測Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113三組細胞中Ang-2基因的不同表達。 (3)裸鼠移植瘤建立：3×10~6個腫瘤細胞接種于裸鼠背部皮下，觀察移植瘤的成瘤時間及生長。 (4)免疫組織化學法：檢測各組腫瘤組織內Ang-2蛋白的表達。 三、結果 1．pcDNA3.1(-)B／Ang-2重組表達質粒的成功構建 Ang-2全長cDNA純化產物在T4連接酶的作用下與pcDNA3.1(-)B載體進行體外基因重組，構建pcDNA3.1(-)B／Ang-2重組表達質粒。經酶切法及核酸雙向測序法鑒定其內含hAng-2基因。 2．穩(wěn)轉Ang-2基因的Tca8113細胞系的成功建立 pcDNA3.1(-)B／Ang-2及pcDNA3.1(-)B通過脂質體轉染法轉入Tca8113細胞系，RT-PCR結果證明只有Tca8113／Ang-2細胞顯示Ang-2陽性條帶，qRT-PCR分析進一步檢測到Tca8113／Ang-2細胞中Ang-2mRNA的表達量是內源性Ang-2mRNA表達的7690倍。 3．Ang-2轉基因的Tca8113細胞裸鼠移植瘤的成功建立 免疫組化結果顯示：在Tca8113／Ang-2組，大量Ang-2陽性染色定位于腫瘤細胞的胞漿和胞膜中，而在Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113組只有少量散在、稀疏的淡黃色染色，進一步從蛋白質水平證實了Ang-2轉基因的舌鱗癌裸鼠移植瘤的成功建立。 4．轉基因表達的Ang-2對舌鱗癌移植瘤成瘤時間的影響 Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113組的平均成瘤時間分別為13.0、4.7和5.1天，可見Ang-2轉基因組成瘤時間長于對照組(P＜0.05)。 5．轉基因表達的Ang-2對舌鱗癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響 Tca8113／Ang-2組腫瘤生長速度較Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113組明顯滯后(P＜0.05)。5周后平均瘤重分別為0.531±0.398g、1.427±0.903g、1.552±0.663g，Tca8113／Ang-2組瘤重較未轉染組明顯降低，差異有顯著意義(P＜0.05)。 四、結論 1．成功構建了真核表達質粒pcDNA3.1(-)B／Ang-2，及Ang-2穩(wěn)轉的舌鱗癌細胞系Tca8113／Ang-2，在此基礎上建立的Ang-2轉基因的舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤可作為研究Ang-2在口腔腫瘤中作用的理想動物模型。 2．轉基因表達的Ang-2延長了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤的成瘤時間。 3．轉基因表達的Ang-2抑制了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤的生長。 第三部分血管生成素2抑制舌鱗癌裸鼠移植瘤生長的有關機制探討 一、研究目的 進一步研究Ang-2抑制腫瘤生長的有關機制，如：Ang-2對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響；對腫瘤血管形態(tài)及微血管密度的影響；及對其它血管生成因子(VEGF、MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS)生成的影響。 二、材料方法 1．組織標本 第二部分實驗留置的Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113三組裸鼠移植瘤組織。 2．方法 (1)Real time RT-PCR法：檢測腫瘤組織內VEGF、MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS mRNA的表達。 (2)免疫組化法：檢測腫瘤組織內增殖細胞核抗原(PCNA)、α-肌動蛋白(α-SMA)、FⅧ。 (3)TUNEL法：檢測腫瘤細胞凋亡。 三、結果 1．轉基因表達的Ang-2對腫瘤血管的形態(tài)，及微血管密度(MVD)的影響Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113三組MVD分別為5.88±1.46、5.33±2.00和5.86±2.41，差別無顯著意義。但Tca8113／Ang-2組血管周圍α-SMA的表達稀少，提示血管壁不完整。 2．轉基因表達的Ang-2促進了腫瘤細胞的凋亡 免疫組化法檢測Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113三組腫瘤細胞的PCNA標記指數分別為34.63±9.40％、57.61±12.26％和54.71±12.82％，Tca8113／Ang-2組較兩對照組下降(P＜0.05)，TUNEL檢測顯示Tca8113／Ang-2組腫瘤組織內凋亡標記指數(19.00±5.48％)較Tca8113／pcDNA3.1(-)B組和Tca8113組增高(10.22±3.42％、10.71±3.30％)，差別有顯著意義(P＜0.05)。 3．VEGF mRNA在各組移植瘤中的表達 實時熒光定量法檢測VEGF在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113三組腫瘤組織內表達為4.37±2.73、4.63±2.96和5.09±3.94，差別無顯著意義(P＞0.05)。 4．MMP-2、MMP-9 mRNA在各組移植瘤中的表達 MMP-2 mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達分別為6.84±3.01、6.76±4.17、8.27±5.24；MMP-9 mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達分別為8.57±5.13、7.76±4.20、9.23±6.10，差異均無顯著意義(P＞0.05)。 5．iNOS、eNOS mRNA在各組移植瘤中的表達 iNOS mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達分別為8.68±5.89、10.13±4.85、9.78±5.76；eNOS mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達分別為10.55±1.77、12.18±2.43、10.78±3.51，差異均無顯著意義(P＞0.05)。 四、結論 1．轉基因表達的Ang-2破壞了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤血管的形態(tài)，對微血管密度無明顯影響。 2．轉基因表達的Ang-2抑制了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤細胞的增殖、促進了腫瘤細胞的凋亡。 3．轉基因表達的Ang-2對舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤中VEGF mRNA的表達無明顯影響。 4．轉基因表達的Ang-2對舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤中MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS mRNA的表達無明顯影響。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R739.8
【圖文】：

GH圖2免疫組化法顯示腫瘤組織及癌旁無瘤組織中Ang一2、vEGF蛋白的表達情況(ZooX)A和B:癌旁無瘤組織中Ang一2不表達(A)或輕度表達(B)。C和D:腫瘤組織中腫瘤細胞(c)及血管內皮細胞(D)上均可見Ang一2的較強表達E和F:癌旁無瘤組織中VEGF不表達(E)或輕度表達(F)。G和H:腫瘤組織中腫瘤細胞(G)及血管內皮細胞(H)上均可見VEGF的較強表達表3腫瘤組織及癌旁無瘤組織中Ang一2蛋白表達的陽性率比較例數Ang一2+陽性率(%)尸值

PCR純化產物在T4連接酶的作用下與peDNA3.1〔)B載體進行體外基因重組構建體DNA3.1‘)B俏刀g一2重組表達質粒。經擴增后抽提質粒，取其中l(wèi)個克隆，雙酶切后電泳初步鑒定，電泳條帶上可見分子量為 1488bP的片段(圖3)，取質粒進行雙向測序(結果見圖4，5)，測序結果與已知的人Ang一2基因序列一致 (accessnum腸沈 :NM001147)

免疫組化結果顯示:在 Tcas113/Ang一2組，大量Ang一2陽性染色定位于腫瘤細胞的胞漿和胞膜中，呈棕黃色或棕褐色顆粒，而在 Tcas113午cDNA3.l(一)B、Tcasll3組只有少量散在、稀疏的淡黃色染色(圖9)，這與其在基因轉錄水平的高低是一致的。以上實驗從蛋白質水平進一步證實了Ang一2轉基因的Tca8113舌鱗癌裸鼠移植瘤的成功建立。

【參考文獻】

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本文編號：2748546