【摘要】： 組織工程學(xué)的發(fā)展為組織缺損的修復(fù)以及器官的重建再造開辟了一條嶄新的道路,構(gòu)建組織工程化組織的研究是目前口腔頜面整形領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)之一。由于牙齒對(duì)于頜面骨的生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)于維持頜面部的美觀,對(duì)于語(yǔ)言、咀嚼功能有著重要的作用,許多國(guó)家試圖利用組織工程學(xué)技術(shù)構(gòu)建組織工程化牙齒。牙本質(zhì)是構(gòu)成牙齒的主體,在組織工程化牙齒的形成過(guò)程中牙本質(zhì)的構(gòu)建是一個(gè)關(guān)鍵。本研究對(duì)構(gòu)建組織工程化牙本質(zhì)的種子細(xì)胞、生物支架材料、組織工程化牙本質(zhì)構(gòu)建等方面進(jìn)行了探討。 目的:利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)來(lái)源廣泛易于獲得和培養(yǎng)的口腔粘膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein1, DMP1)基因轉(zhuǎn)染,獲得牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的口腔粘膜成纖維細(xì)胞(dentin matrix protein1-porcine oral mucosa fibroblasts, DMP1-POMF),通過(guò)對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的口腔粘膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)性能、成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性基因蛋白表達(dá)的觀察,探討構(gòu)建組織工程化牙本質(zhì)的種子細(xì)胞。 利用建立的組織工程化牙本質(zhì)種子細(xì)胞(牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的口腔粘膜成纖維細(xì)胞,DMP1-POMF)復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)HE染色光鏡觀察、掃描電鏡觀察、流式細(xì)胞檢測(cè)探討DMP1-POMF種子細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的相容性,評(píng)價(jià)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為構(gòu)建組織工程化牙本質(zhì)支架材料的可行性;通過(guò)裸鼠肌肉內(nèi)植入DMP1-POMF復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架材料,觀察其在動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)的變化、牙本質(zhì)特異性基因蛋白的表達(dá),探討組織工程化牙本質(zhì)的構(gòu)建。 對(duì)建立的組織工程化牙本質(zhì)種子細(xì)胞(牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的口腔粘膜成纖維細(xì)胞,DMP1-POMF)進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)三維立體培養(yǎng),通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、蛋白表達(dá)定量分析,評(píng)價(jià)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)DMP1-POMF細(xì)胞的生物學(xué)特性和成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性基因蛋白的表達(dá);通過(guò)DMP1-POMF細(xì)胞團(tuán)體內(nèi)蓋髓的組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè),評(píng)價(jià)組織工程化牙本質(zhì)種子細(xì)胞(牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的口腔粘膜成纖維細(xì)胞,DMP1-POMF)細(xì)胞團(tuán)三維立體培養(yǎng)在修復(fù)牙本質(zhì)缺損中的作用。 方法: 1 pEGFP-DMP1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。參照2006年3月Kim J等發(fā)表的豬DMP1全基因序列,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成并構(gòu)建了重組綠色熒光融合蛋白pEGFP-DMP1質(zhì)粒。 重組質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增提取后用XhoI和EcoRI雙酶切,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。確定后對(duì)全基因序列進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。 2細(xì)胞培養(yǎng)及牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP1)基因轉(zhuǎn)染 2.1豬口腔粘膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及來(lái)源鑒定 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所購(gòu)買10月齡中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬,3%戊巴比妥鈉耳后肌肉麻醉,無(wú)菌條件下留取頰粘膜固有層結(jié)締組織標(biāo)本,置含抗生素預(yù)冷DMEM培養(yǎng)液中,剪成約1mm3的小塊,在含10% FBS的DMEM,37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)豬口腔粘膜成纖維細(xì)胞(porcine oral mucosa fibroblasts, POMF)。 免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白抗體染色,作細(xì)胞來(lái)源鑒定。第四代細(xì)胞用于基因轉(zhuǎn)染。 2.2骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)體外分離與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)豬經(jīng)麻醉后,用16號(hào)穿刺針于股骨大轉(zhuǎn)子處穿刺,抽取骨髓4ml,置于肝素化的25ml無(wú)菌培養(yǎng)液中,1000r/min離心10min,棄上清,在含10%FBS的DMEM,37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。5天后全量換液,以后每周2次換液。第三代細(xì)胞用于基因轉(zhuǎn)染,作為口腔粘膜成纖維細(xì)胞(POMF)的對(duì)照組。 2.3 DMP1基因轉(zhuǎn)染及篩選 轉(zhuǎn)染前用含10%FBS的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105接種于6孔板中,CO2孵箱培養(yǎng)至60%匯合。將細(xì)胞分為三組: A組:為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染豬口腔粘膜成纖維細(xì)胞組,對(duì)口腔粘膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染,本研究將其命名為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的豬口腔粘膜成纖維細(xì)胞(dentin matrix protein1- porcine oral mucosa fibroblasts, DMP1-POMF)。 B組:為載體基因轉(zhuǎn)染口腔粘膜成纖維細(xì)胞組,對(duì)口腔粘膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1基因,本研究將其命名為載體基因轉(zhuǎn)染的口腔粘膜成纖維細(xì)胞(pEGFP-C1-porcine oral mucosa fibroblasts,C1-POMF)。 C組:為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞組,對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染,本研究將其命名為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)染的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(dentin matrix protein1- mesenchymal stem cells,DMP1-MSC)。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,按1

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