【摘要】：目的: 涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是最常見的涎腺惡性腫瘤，約占涎腺惡性腫瘤的22%。此腫瘤無包膜，侵襲性很強。嗜神經(jīng)生長和遠處轉(zhuǎn)移是涎腺腺樣囊性癌的兩大惡性生物學特性，其中肺臟是涎腺腺樣囊性癌遠處轉(zhuǎn)移最常發(fā)生的部位，也是臨床上涎腺腺樣囊性癌患者死亡的主要原因之一。 涎腺腺樣囊性癌由腫瘤性肌上皮細胞（neoplastic myoepithelial cells,NMCs）和腫瘤性腺上皮細胞構(gòu)成。腫瘤性肌上皮細胞具有雙向分化的特征，它不僅具有正常肌上皮細胞的收縮功能，還具有平滑肌分泌蛋白多糖（proteoglycans, PGs）的功能。蛋白多糖分布于涎腺腺樣囊性癌腫瘤細胞團塊中，形成大小不等的囊樣腔隙，呈篩孔狀分布于腫瘤實質(zhì)區(qū)，形成了涎腺腺樣囊性癌特征性的組織學結(jié)構(gòu)。蛋白多糖為涎腺腺樣囊性癌的生長提供必要的營養(yǎng)來源。 硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPGs）是一類由核心蛋白和（乙酰）硫酸肝素（heparan sulfate, HS）多糖鏈組成的蛋白多糖的總稱。根據(jù)核心蛋白結(jié)構(gòu)的不同，HSPGs主要包括位于細胞膜表面的磷脂酰肌醇蛋白多糖家族（glypicans, GPCs）和多配體蛋白多糖家族（syndecans, SDCs），以及位于細胞外基質(zhì)中的基膜蛋白多糖（perlecan/HSPG2）、XVIII型膠原和集聚蛋白多糖（agrin）。GPCs家族包括六個成員：GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6；SDCs家族包括四個成員：SDC1、SDC2、SDC3、SDC4。以往的研究表明，HSPGs廣泛分布于涎腺腺樣囊性癌腫瘤細胞及細胞外基質(zhì)。并可作為受體、共受體參與細胞增殖、細胞粘附、基質(zhì)聚集、凝血等正常生理過程，也參與傷口愈合、炎癥、腫瘤細胞的遷移及侵襲等過程。 本研究擬檢測HSPGs，包括細胞膜HSPGs（SDCs家族和GPCs家族）與基膜HSPG（perlecan），在涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細胞株SACC-M、低轉(zhuǎn)移細胞株SACC-2、涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-83及伴或不伴有肺轉(zhuǎn)移涎腺腺樣囊性癌組織中的表達，并分析探討HSPGs異常表達，在涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移過程中的作用。 方法： 第一部分硫酸乙酰肝素蛋白多糖在涎腺腺樣囊性癌中的表達 1HSPGs在涎腺腺樣囊性癌細胞株中的表達 本部分研究選擇以下細胞株： 涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細胞株SACC-M； 涎腺腺樣囊性癌低轉(zhuǎn)移細胞株SACC-2； 涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-83。 1.1涎腺腺樣囊性癌SACC-M、SACC-2、SACC-83的細胞培養(yǎng)將SACC-M、SACC-2、SACC-83細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，pH值為7.2）中，于37C、5%CO_2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 1.2細胞總RNA提取 Trizol法分別提取SACC-M、SACC-2、SACC-83細胞總RNA； 分光光度計260nm及280nm波長檢測RNA純度及濃度； 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。 1.3反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA。 1.4Real-Time PCR檢測 本研究采用Real-Time PCR（CT相對定量法）檢測主要HSPGs，兩大細胞膜HSPGs（SDCs家族和GPCs家族）與基膜HSPG（perlecan），在涎腺腺樣囊性癌不同細胞株（SACC-M、SACC-2、SACC-83）的相對表達水平。 2檢測GPC5蛋白在涎腺腺樣囊性癌細胞株中的表達 本部分研究根據(jù)前述實驗結(jié)果，選擇高表達的硫酸乙酰肝素蛋白多糖——GPC5作為研究目的基因，檢測其在不同轉(zhuǎn)移潛能的涎腺腺樣囊性癌細胞株中的表達。 2.1免疫熒光細胞化學檢測 采用兔抗人GPC5單克隆抗體，通過免疫熒光細胞化學法檢測GPC5蛋白在涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-M、SACC-2和SACC-83細胞中的表達與分布。 2.2Western blot檢測 采用鼠抗人GPC5單克隆抗體，通過Western blot檢測GPC5蛋白在SACC-M、SACC-2、SACC-83細胞中的相對表達量。 3檢測GPC5蛋白在伴或不伴有肺轉(zhuǎn)移涎腺腺樣囊性癌中的表達 收集臨床涎腺腺樣囊性癌16例，其中肺轉(zhuǎn)移5例，無肺轉(zhuǎn)移11例。免疫組織化學法檢測GPC5蛋白在涎腺腺樣囊性癌腫瘤組織中的表達，觀察分析伴或不伴有肺轉(zhuǎn)移涎腺腺樣囊性癌腫瘤中GPC5蛋白的表達差異。 第二部分靶向沉默人GPC5基因miRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 1miRNA干擾載體的設計及構(gòu)建 針對靶基因（human GPC5, Gene ID:2262）設計干擾序列并合成一套miRNA干擾載體。一套miRNA干擾載體包含4個miRNA oligos，以及陰性對照序列Oligo，退火后序列亞克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體。 2測序驗證 每個轉(zhuǎn)化平板分別挑取3個克隆，搖菌抽提質(zhì)粒后進行測序，以驗證重組克隆中插入片段序列是否與設計的序列一致。 3質(zhì)粒中量抽提 4質(zhì)粒靶向沉默效果的鑒定 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SACC-M細胞，Real-TimePCR（CT相對定量法）檢測4個構(gòu)建質(zhì)粒的沉默效率。 第三部分沉默人GPC5基因表達對涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移作用的研究 1試驗分組 基因沉默組：GPC5-silenced，GPC5干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SACC-M細胞組； 陰性對照組：GPC5-NC，陰性對照質(zhì)粒NC轉(zhuǎn)染SACC-M細胞組； 空白對照組：SACC-M，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的SACC-M細胞組。 2建立穩(wěn)定沉默人GPC5基因細胞株 2.1SACC-M細胞培養(yǎng)，確定殺稻瘟菌素對SACC-M細胞的最小致死濃度及篩選濃度。 2.2通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導靶向沉默GPC5基因的miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SACC-M細胞，并利用藥物（殺稻瘟菌素）篩選單克隆，建立穩(wěn)定沉默人GPC5基因表達的細胞株（GPC5-silenced細胞），同時轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒（NC質(zhì)粒）進入SACC-M細胞株，建立陰性對照細胞株（GPC5-NC細胞）。 2.3質(zhì)粒靶向沉默效率的鑒定 mRNA水平鑒定：Real-Time PCR檢測GPC5基因在GPC5-silenced、GPC5-NC、SACC-M細胞的表達； 蛋白水平鑒定：Western blot檢測GPC5蛋白在GPC5-silenced、GPC5-NC、SACC-M細胞的表達。 3涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移體內(nèi)抑制試驗 選擇18只BLAB/C nu裸鼠，4周齡，雄性，隨機分為3組，分別進行尾靜脈注射GPC5-silenced細胞、GPC5-NC細胞和SACC-M細胞，2×107/ml×0.2ml/只。SPF條件下飼養(yǎng)，第4周麻醉處死，稱重新鮮肺組織濕重。10%福爾馬林固定，HE染色，光鏡下觀察，進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果： 第一部分硫酸乙酰肝素蛋白多糖在涎腺腺樣囊性癌中的表達 1HSPGs在涎腺腺樣囊性癌細胞株中的表達 Real-Time PCR相對定量（CT相對定量法）分析結(jié)果顯示，與SACC-2細胞相比，11種主要HSPGs在SACC-M細胞中的表達，其中SDC2、GPC3、GPC5表達分別上調(diào)1.50、2.58、3.24倍；與SACC-83細胞相比，11種主要HSPGs在SACC-M細胞中的表達，其中SDC2和GPC5表達分別上調(diào)15.32倍和815.69倍。 GPC5在涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細胞株SACC-M細胞中的表達明顯上調(diào)3倍以上。 2GPC5蛋白在SACC-M、SACC-2、SACC-83中的表達 免疫熒光細胞化學法檢測結(jié)果顯示，GPC5蛋白在涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-M、SACC-2、SACC-83中均有表達，其中在涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移株SACC-M中表達最高，SACC-2表達次之，在SACC-83細胞中呈弱表達。另外，GPC5不僅在細胞膜表面有表達，而且在細胞漿部位亦有表達。 Western blot檢測結(jié)果顯示，GPC5蛋白在涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細胞株SACC-M中的表達是SACC-2的3.41倍，是SACC-83表達的675.00倍。 3GPC5蛋白在伴或不伴有肺轉(zhuǎn)移涎腺腺樣囊性癌原發(fā)腫瘤中的表達 免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，GPC5蛋白在涎腺腺樣囊性癌腫瘤組織中表達，主要沉積在腫瘤細胞的細胞膜、細胞漿。另外，在部分假性囊腔和腺腔內(nèi)細胞外基質(zhì)中也有沉積。且GPC5蛋白在伴有肺轉(zhuǎn)移的涎腺腺樣囊性癌組織表達明顯高于不伴有肺轉(zhuǎn)移的腫瘤，差別具有顯著性（P 0.05）。 第二部分靶向沉默人GPC5基因miRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 1構(gòu)建靶向沉默GPC5基因的miRNA干擾質(zhì)粒 成功構(gòu)建靶向沉默GPC5基因的miRNA干擾質(zhì)粒12MR0055-1-1、12MR0055-2-1、12MR0055-3-1、12MR0055-4-2及陰性對照質(zhì)粒NC，并進行測序驗證； 2質(zhì)粒靶向沉默效率的鑒定 脂質(zhì)體介導質(zhì)粒12MR0055-1-1、12MR0055-2-1、12MR0055-3-1、12MR0055-4-2及NC轉(zhuǎn)染SACC-M細胞。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時后，均可見有綠色熒光蛋白表達，分別收集細胞并提取細胞總RNA，Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示，質(zhì)粒12MR0055-1-1、12MR0055-2-1、12MR0055-3-1、12MR0055-4-2對靶基因GPC5的沉默效率分別達到80.5%、78.1%、80.3%、89.7%。 第三部分沉默人GPC5基因表達對涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移作用的研究 1建立穩(wěn)定沉默GPC5基因的細胞株 通過脂質(zhì)體介導miRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染SACC-M細胞株，在基因轉(zhuǎn)染48小時，加入殺稻瘟菌素，進行藥物篩選，建立靶向沉默GPC5基因的穩(wěn)定細胞株GPC5-silenced，以及陰性對照細胞株GPC5-NC。 mRNA水平檢測結(jié)果顯示沉默效率達到89.7%； 蛋白水平檢測結(jié)果顯示沉默效率達到96.5%。 2涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移體內(nèi)抑制試驗 裸鼠肺轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果顯示，GPC5基因沉默組（GPC5-silenced）裸鼠肺轉(zhuǎn)移2例（轉(zhuǎn)移率33.33%），陰性對照組（GPC5-NC組）裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移6例（100%），空白對照組SACC-M組裸鼠肺轉(zhuǎn)移6例（100%），GPC5-silenced組與GPC5-NC組、SACC-M組相比，差異具有顯著性（P 0.05）；GPC5-NC組與SACC-M組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 新鮮肺組織濕重，GPC5基因沉默組（GPC5-silenced組）肺濕重（0.507±0.223g）明顯低于陰性對照GPC5-NC組（1.177±0.342g）和空白對照SACC-M組（1.045±0.539g），差異具有顯著性（P 0.05）；GPC5-NC組與SACC-M組比較，差別無顯著性（P0.05）。 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，SACC-M組和GPC5-NC組中正常肺組織結(jié)構(gòu)消失，雙肺內(nèi)充滿腫瘤細胞轉(zhuǎn)移灶，腫瘤灶呈圓形或橢圓形。腫瘤細胞排列成致密的實性團塊。腫瘤細胞圓形或多邊性，排列緊密，胞漿嗜伊紅染色，著色較淺，細胞胞核呈圓形，核分裂像多見，細胞核異型性明顯。另外，肺組織內(nèi)可見大量毛細血管擴張、充血。GPC5-silenced組2個肺轉(zhuǎn)移標本中，正常肺組織結(jié)構(gòu)清晰，偶見散在分布的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，且體積較SACC-M組及GPC5-NC組轉(zhuǎn)移灶小，包膜不完整包膜。其余4個肺組織未見轉(zhuǎn)移，肺組織結(jié)構(gòu)正常。 結(jié)論： 硫酸乙酰肝素蛋白多糖GPC5基因高表達，能夠增強涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移的能力。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.8

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