【摘要】：腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是涎腺最常見的惡性腫瘤之一,常好發(fā)于小涎腺。該腫瘤起病隱蔽,生長緩慢,侵襲性強(qiáng),易復(fù)發(fā)、易早期轉(zhuǎn)移,且對常規(guī)的化療、放療等治療措施不敏感,因其有沿著周圍組織的神經(jīng)血管潛行性生長的特點(diǎn),而確切定位神經(jīng)受侵部位尚無客觀手段,從而給臨床手術(shù)完全切除腫瘤帶來較大困難。切除范圍不足時,術(shù)后易復(fù)發(fā);而盲目擴(kuò)大切除,必然給患者帶來不必要的畸形和功能障礙。因而綜合治療效果和遠(yuǎn)期療效均不理想。隨著基因治療的興起,深入研究涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,sacc)的生物學(xué)特性,從基因和蛋白水平來探討SACC的發(fā)生機(jī)制,尋找與SACC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),基因治療也成為未來最具潛力的有效根治SACC的方法。 IBP(IRF-4 binding protein, IRF-4結(jié)合蛋白)是一種主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞并具有重要功能的蛋白質(zhì)。它參與TCR信號刺激下T細(xì)胞免疫突觸的形成;與Th2細(xì)胞的分化密切相關(guān);通過抑制IRF-4的轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)控介素17與介素21的產(chǎn)生,影響Th17細(xì)胞的功能;影響MAPKs與NF-κB參與TLRs傳導(dǎo)通路;在維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。IBP knockout小鼠表現(xiàn)為自身免疫免疫性疾病的癥狀。另外,IBP具有GEF(鳥苷酸交換因子)的作用,能夠激活Rho GTPase家族的部分成員。以上這些研究結(jié)果均提示IBP可以參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)、細(xì)胞極化、細(xì)胞間的信息傳遞等多種重要的生理過程。近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IBP在結(jié)腸癌及乳腺癌中高表達(dá)并起著重要的作用。但I(xiàn)BP在SACC中的表達(dá)及功能還未見報道。本課題首次以SACC為研究對象,對IBP在SACC和正常涎腺中的表達(dá)及其可能的臨床意義進(jìn)行研究,并建立了穩(wěn)定高表達(dá)IBP的SACC細(xì)胞株,通過體外試驗(yàn)證實(shí)IBP在SACC中的功能及其可能的機(jī)制。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果: 一、IBP在SACC和正常涎腺中的表達(dá)及其臨床意義的研究 1、利用ACC2、ACCM等2株SACC細(xì)胞株通過Western Blot技術(shù)檢測IBP的表達(dá)情況;結(jié)果顯示:IBP在ACC2、ACCM細(xì)胞株中均陰性表達(dá)。 2、收集了27例SACC石蠟標(biāo)本和20例正常涎腺組織標(biāo)本,通過免疫組化染色對IBP在臨床樣本中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,并將其與臨床樣本的其它病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定其臨床意義;結(jié)果表明:27例SACC中僅3例IBP基因表達(dá)弱陽性,20例正常涎腺組織中則全部表達(dá)陽性,兩組間存在顯著性差異(P0.05)。而IBP的表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤部位均無明顯的相關(guān)性(P0.05)。 二、IBP在SACC中的功能及其機(jī)制的研究 1、利用IBP陰性表達(dá)的ACC2細(xì)胞,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建IBP過表達(dá)細(xì)胞模型;通過Western Blot檢測證實(shí)獲取了穩(wěn)定高表達(dá)IBP的ACC2-C1/IBP細(xì)胞株。 2、通過MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況,確定IBP對細(xì)胞增殖的影響;結(jié)果表明:IBP抑制SACC細(xì)胞的增殖。 3、通過平板克隆形成試驗(yàn),檢測IBP對ACC2細(xì)胞克隆形成能力的影響;結(jié)果證實(shí):IBP能抑制SACC細(xì)胞的克隆形成能力。 4、采用Transwell試驗(yàn),將穿膜細(xì)胞進(jìn)行染色計(jì)數(shù)分析各組細(xì)胞侵襲能力的變化,明確IBP對細(xì)胞侵襲能力的影響;結(jié)果表明:IBP有促進(jìn)SACC細(xì)胞侵襲的作用。 5、通過臨床常用的SACC治療藥物紫杉醇為誘導(dǎo)劑,觀察IBP的表達(dá)對SACC細(xì)胞耐受紫杉醇?xì)芰Φ挠绊?結(jié)果提示:IBP在一定程度上還具有紫杉醇抗藥性。 6、利用微管蛋白Tubulin免疫熒光染色,觀察IBP與微管的關(guān)系,并觀察紫杉醇作用前后微管的變化;結(jié)果表明:IBP與微管有一定程度的共定位,并能促進(jìn)微管的解聚。 7、通過波形蛋白和角蛋白的免疫熒光染色,初步探討了IBP與EMT的關(guān)系;初步證實(shí)了IBP能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。 綜上所述, IBP在正常涎腺中存在高表達(dá),在SACC中則低表達(dá)甚至不表達(dá);SACC中IBP的表達(dá)具有抑制增殖、促進(jìn)侵襲的作用,并對紫杉醇耐藥,能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。上述研究成果能為臨床SACC的的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)及方向,并對臨床化療用藥的選擇具有指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.8
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文水透明：50%乙醇，1min→70%乙醇，1min→90%乙醇，1min→無水乙乙醇，2min→二甲苯/無水乙醇(1：1)，5min→二甲苯，5min→二甲苯封片。BS 代替一抗作為陰性對照。鏡觀察并拍照，采用 χ2檢驗(yàn)分析 IBP 的表達(dá)與 SACC 相關(guān)參數(shù)的結(jié) 果SACC 細(xì)胞株 IBP 表達(dá)的 WB 檢測鑒定 ACC2、ACCM 細(xì)胞株的 IBP 表達(dá)情況，分別提取細(xì)胞株 ACC照人白血病細(xì)胞株 Jurkat 的總蛋白，利用 Western blot 檢測 IBP 的測，確認(rèn) ACC2、ACCM 細(xì)胞中未見 IBP 的表達(dá)(如圖 1 所示)。

IBP在正常涎腺組織和腺樣囊性癌中的表達(dá)(S-P×40)

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本文編號：2739161