【摘要】：目的 觀察分析不同流體剪切應(yīng)力作用下力學(xué)信號在成骨細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。 方法 1.細(xì)胞培養(yǎng):成骨細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)液中常規(guī)條件下培養(yǎng),細(xì)胞生長接近融合成單層時,0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA常規(guī)消化,制成細(xì)胞懸液,倒置相差顯微鏡下細(xì)胞計數(shù),以10~4/ml細(xì)胞密度接種已處理好的載玻片置于CO_2孵箱(37℃,5%CO_2,95%空氣)繼續(xù)培養(yǎng),每兩天換一次液。 2.細(xì)胞成骨性能鑒定: (1)活體相差顯微鏡觀察 (2)堿性磷酸酶(ALP)染色(采用改良鈣鈷法) (3)骨鈣素(BGP)免疫組化染色(即用型SABC法) (4)礦化結(jié)節(jié)染色(茜素紅染色和von Kossa染色) 3.細(xì)胞加力: 運(yùn)用定常流加載系統(tǒng),在完全密閉無菌的情況下對細(xì)胞玻片進(jìn)行加力,蠕動泵可以調(diào)控液體流速,以控制流體剪切力。 4.觀察分析不同流體剪切力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用不同時間(15min,30min,60min,120min)時,力學(xué)信號對成骨細(xì)胞形態(tài)及增殖能力的影響;并且對應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞內(nèi)骨鈣素陽性表達(dá)狀況進(jìn)行了初步分析。 (1)HE染色倒置相差顯微鏡觀察展示細(xì)胞形態(tài) (2)MTT法測定細(xì)胞增殖活性 (3)用Image-pro plus圖像分析軟件處理,對細(xì)胞面積及免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析 結(jié)果 1.不同流體剪切應(yīng)力作用對成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響 (1)強(qiáng)度為7dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞面積的影響:與對照組比較,強(qiáng)度為7dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min、120min時細(xì)胞形態(tài)均有變化,細(xì)胞胞突及長軸擺動方向與應(yīng)力方向趨于一致;本實(shí)驗細(xì)胞面積測定結(jié)果顯示:與對照組比較,強(qiáng)度為7dynes/cm~2的流體剪切力作用30min、60min、120min時細(xì)胞面積變化有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),但作用15min時細(xì)胞面積變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 (2)強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞面積的影響:與對照組比較,強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min時細(xì)胞形態(tài)均有變化,細(xì)胞胞突及長軸擺動方向與應(yīng)力方向趨于一致;但本實(shí)驗中觀察到受力時間為120min時,細(xì)胞形態(tài)變化較異常,可觀察到細(xì)胞核邊集,呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,細(xì)胞排列方向性不明顯。本實(shí)驗細(xì)胞平均面積測定結(jié)果顯示:強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用60min和120min時細(xì)胞面積與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而作用15min和30min與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05). (3)不同的流體剪切應(yīng)力作用(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)對成骨細(xì)胞細(xì)胞面積影響的比較分析: 本實(shí)驗細(xì)胞平均面積測定結(jié)果比較顯示:兩種不同強(qiáng)度的流體剪切力作用對細(xì)胞面積的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05). 2.不同流體剪切應(yīng)力作用對成骨細(xì)胞增殖活性的影響 (1)強(qiáng)度為7dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖活性的影響: 本實(shí)驗結(jié)果顯示:與對照組比較,強(qiáng)度為7dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min時細(xì)胞的增殖活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);受力組間比較表明:受力60min時細(xì)胞的增殖活性最強(qiáng)(P＜0.05),而受力15min與30min時細(xì)胞增殖活性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義. (2)強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖活性的影響: 本實(shí)驗結(jié)果顯示:與對照組(0min)對比,強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min時細(xì)胞的增殖活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);受力組間比較結(jié)果表明:受力60min時細(xì)胞的增殖活性明顯提高(P＜0.05),而受力15min與30min時細(xì)胞的增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義. (3)不同的流體剪切應(yīng)力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用對成骨細(xì)胞增殖活性影響的比較分析: 本實(shí)驗結(jié)果顯示:兩種不同強(qiáng)度(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)的剪切應(yīng)力作用對細(xì)胞增殖活性的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),其中12dynes/cm~2的流體剪切力作用60min時細(xì)胞的增殖活性最強(qiáng)。 3.強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力作用不同時間對成骨細(xì)胞內(nèi)BGP陽性表達(dá)的影響: 本實(shí)驗結(jié)果顯示:與對照組(0min)比較,強(qiáng)度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用60min時細(xì)胞內(nèi)BGP陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),具有明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)BGP表達(dá)增加的作用;而作用15min和30min時細(xì)胞內(nèi)BGP陽性表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;受力組間比較顯示:受力60min時細(xì)胞內(nèi)BGP的陽性表達(dá)增高明顯,與受力15min、30min相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05). 結(jié)論 不同的流體剪切應(yīng)力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用下力學(xué)信號均能引起成骨細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生效應(yīng)性的變化,本研究結(jié)果表明了力學(xué)信號可引起成骨細(xì)胞形態(tài)、增殖活性及骨鈣素表達(dá)等發(fā)生效應(yīng)性改變,其中12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力作用60min具有較強(qiáng)的促成骨細(xì)胞增殖分化的能力。本實(shí)驗結(jié)果將對第二階段關(guān)于流體剪切應(yīng)力下種植體細(xì)胞界面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其關(guān)鍵功能蛋白的研究起到鋪墊和基礎(chǔ)作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R78
【圖文】：

圖1:MG一63細(xì)胞ALP染色:陽性細(xì)胞胞漿圖2:MG一63細(xì)胞骨鈣素(BGP)免疫組化檢測:有黑色顆粒沉著(200又)(GomoriCa一Co)陽性細(xì)胞呈棕褐色(200x)(即用型ABC法)圖3:礦化結(jié)節(jié)染色茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)呈圖4:礦化結(jié)節(jié)vonkossa染色法染色，礦化深紅色(10Ox)結(jié)節(jié)被硝酸銀液染成黑色(IOOX).2.2正常MG-63的細(xì)胞形態(tài)

1.2.1成骨細(xì)胞性能檢測成骨細(xì)胞株MG一63堿性磷酸酶(ALP)染色(見圖l)，骨鈣素(BGP)免疫組化染色(即用型SABC法)及礦化能力檢測均呈陽性(見圖2，3，4)。圖1:MG一63細(xì)胞ALP染色:陽性細(xì)胞胞漿‘一卜奮湯.‘獷圖2:MG一63細(xì)胞骨鈣素(BGP)免疫組化檢測:有黑色顆粒沉著(200又 )(GomoriCa一Co)陽性細(xì)胞呈棕褐色(200x)(即用型ABC法)圖3:礦化結(jié)節(jié)染色茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)呈圖4:礦化結(jié)節(jié) vonkossa染色法染色，礦化深紅色(10Ox)結(jié)節(jié)被硝酸銀液染成黑色(IOOX)1.2.2正常MG-63的細(xì)胞形態(tài)在細(xì)胞爬片上隨機(jī)選擇視野清楚且形態(tài)清晰的視野，用倒置相差顯微鏡在20、10倍光鏡下拍照，觀察到正常未加力MG一63細(xì)胞有梭形、三角形、球形、紡錘形等多種不規(guī)則的形態(tài)，偶見癌巨細(xì)胞，多核細(xì)胞及多極分裂相細(xì)胞，核質(zhì)比例較大

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2725314