發(fā)布時間：2020-06-21 07:27

【摘要】： 背景與目的: 齲病是一種發(fā)病率很高的疾病,現(xiàn)代病因學認為齲病是一種細菌感染性疾病,其發(fā)生與多種因素有關,其中牙菌斑在牙面的形成是齲病發(fā)生的先決條件。大量的研究表明在牙菌斑的形成及致齲過程中變形鏈球菌起著至關重要的作用,被認為是主要的致齲菌。變形鏈球菌在牙面的粘附、聚集是其致齲作用首要的和關鍵的一步,也是最為重要的一步。因此通過主動或被動免疫的方法來封閉、失活變形鏈球菌菌體表面參與粘附和聚集的毒力因子,阻止變形鏈球菌在牙面的粘附聚集從而降低其致齲力,一直是齲病免疫預防研究的焦點。近年來,隨著基因治療的飛速發(fā)展,防齲DNA疫苗的研究也成為齲病防治領域的熱點。在前期的研究中我們已經(jīng)成功地構建了載有與變形鏈球菌最初附著有關的表面蛋白抗原AgⅠ/Ⅱ的唾液結合區(qū)段(Saliva-binding region,SBR)基因的雙啟動子表達載體pCN-SSIE(含真核啟動子CMV和原核啟動子Nir),和載有變形鏈球菌葡糖基轉移酶葡聚糖結合區(qū)(Glucan-binding region,GBR)基因的表達載體pTriEx-4-GBR,且證實了它們的免疫原性。本實驗的目的是構建載有SBR和GBR基因的二價雙啟動子表達載體pCN-SSISG。并檢測其在原核細胞減毒沙門氏菌SL3261中的表達情況以及以減毒沙門氏菌為DNA疫苗載體通過口服在動物小鼠體內免疫的情況。 方法: 根據(jù)GenBank公布的S.mutans glucosyltransferase(gtfB and gtfC)genes基因序列(序列號M17361)設計一對特異性引物,上游引物5′端含有限制性內切酶HindⅢ位點;下游引物5′端含有XhoⅠ的酶切位點。利用PCR技術從載有變形鏈球菌gtfB基因的質粒中擴增葡聚糖結合區(qū)段(GBR)的基因片段,然后將合成的組織纖溶酶原信號肽序列(tPA-SP)連接到GBR基因的上游,再將此基因(sGBR)定向克隆到載有sSBR基因的雙啟動子表達載體pCN-SSIE上,構建出pCN-SSISG.。通過酶切分析和DNA測序證明雙啟動子表達質粒pCN-SSISG構建成功后,再用該質粒轉化減毒沙門氏菌SL3261,并用轉化子口服免疫小鼠;同時利用在前期研究中已構建好的原核表達載體pTriEx-4-SBR和pTriEx-4-GBR在大腸桿菌JM109(DE3)中分別誘導表達抗原蛋白SBR和GBR,并應用HisTrap~(TM)蛋白純化試劑盒純化后,皮下免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和Westemblotting檢測pCN-SSISG在原核細胞減毒沙門氏菌SL3261中表達SBR和GBR蛋白的情況,和以減毒沙門氏菌為載體在小鼠體內誘導的全身及粘膜免疫反應情況。 結果: 通過對重組質粒pCN-SSISG的酶切鑒定以及DNA序列測定分析,證明重組表達載體pCN-SSISG構建成功、開放閱讀框架正確;SDS-PAGE表明在減毒沙門氏菌SL3261中pCN-SSISG能正常表達目的蛋白,其條帶大小與預期結果相符,Western blot也檢測到了SBR和GBR蛋白的表達。這些結果表明質�？梢栽谠思毎姓９ぷ�。同時用ELISA間接法和Western blotting檢測口服免疫小鼠的血清抗體,結果顯示制備的小鼠血清能特異地結合在原核細胞中表達及純化的SBR和GBR融合蛋白,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)結果顯示:在以減毒沙門氏菌為載體口服免疫的小鼠血清及唾液中,都檢測到了明顯高于對照組的高水平的抗SBR和GBR特異性抗體IgG、IgA。 結論: 本實驗利用PCR、T-A克隆等分子生物學技術成功地將編碼SBR及GBR的基因定向克隆到表達載體pCMVnir上,構建出了一個新的特別適合以減毒沙門氏菌為載體的二價雙啟動子DNA疫苗pCN-SSISG;它在原核細胞中能夠良好地表達,且能誘導機體產生良好的免疫反應,為進一步的實驗研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R78
【圖文】：

將擴增后的GBR目的片段克隆蛋白胞外分泌的組織型纖溶酶原信號膚序列，構建重組質粒pTriEx一4一SG，轉化篩選后酶條約5000bP的條帶，信號膚序列的長度為GBR片段的5‘端，構建成sGBR。最后別用BamHI、Xhol雙酶切，回收目的和載N一ssISG。BamHI、乃01雙酶切電泳表明，bp，與預期相符。序列測定結果證明GBRtansglueosyltransferase(gtfBandgtfC)genes切鑒定結果如圖1:

到0.3~0.6時，加入IPTG至終濃度IITunol/L繼續(xù)培養(yǎng)，誘導表達5小時后，取同時培養(yǎng)的陽性克隆未誘導組以及JM109(DE3)空白組菌液lml進SDS一PAGE電泳比較，結果如圖。

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本文編號：2723748