【摘要】： 吸煙損傷牙周組織,是慢性牙周炎的主要危險因素。吸煙人群牙周炎的發(fā)病率遠遠高于非吸煙人群,并且在牙周炎患者中,吸煙人群的牙周組織破壞更加明顯。尼古丁作為煙草中的主要生物堿,除可直接損傷牙周組織,還可通過妨礙牙周組織免疫系統(tǒng)正常功能加速其損壞,但確切作用機制尚未明了。 研究發(fā)現(xiàn),膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase,ChAT)在尼古丁對機體組織損傷過程中發(fā)揮重要作用。為觀察膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase , ChAT)在人牙周膜成纖維細胞(Periodontal ligament fibroblast,PDLF)中的表達,并探討ChAT調節(jié)在參與尼古丁對PDLF損傷過程中的作用,本研究通過建立尼古丁作用下PDLF體外實驗模型,采用RT-PCR,DNA測序和免疫組化等方法,觀察PDLF中是否存在ChAT及在尼古丁作用下其表達的改變。旨在探討ChAT在尼古丁與吸煙相關性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用,為尋找新的牙周炎防治途徑提供理論和實驗依據(jù)。 1人牙周膜成纖維細胞中ChAT的表達 取12-18歲志愿者正畸減數(shù)拔除的健康第一前磨牙,刮取根中1/3處牙周膜組織,改良組織塊法原代培養(yǎng)PDLF,鑒定,傳代,4-6代細胞用于實驗。采用免疫熒光及RT-PCR方法檢測PDLF中ChAT的表達。免疫熒光結果顯示,PDLF胞漿中存在ChAT的陽性表達;RT-PCR結果顯示在與陽性對照組相同位置299 bp處可見陽性條帶,且經(jīng)克隆測序證實擴增產(chǎn)物為ChAT。初步證實,在PDLF中存在ChAT蛋白及mRNA表達。 2尼古丁對ChAT在人牙周膜成纖維細胞中表達的影響 第4代PDLF隨機分為兩組,對照組:5%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液;實驗組:尼古丁硫酸鹽(10-12mol/L)溶于含5%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液。37℃、5% CO2孵箱中孵育24h。RT-PCR、實時定量PCR及免疫熒光方法檢測尼古丁對ChAT在PDLF表達的影響。 免疫熒光結果顯示,正常及尼古丁作用下PDLF存在ChAT陽性表達,表達主要位于胞漿。與對照組相比,尼古丁作用24h后,實驗組PDLF ChAT陽性信號增強。RT-PCR結果表明,與對照組相比,尼古丁作用24h后PDLF PCR擴增產(chǎn)物ChAT mRNA陽性表達增強;經(jīng)quantity one分析,表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05),實時定量PCR進一步證實該結果。 以上結果證實,PDLF中存在ChAT蛋白、mRNA表達;尼古丁可明顯上調其表達。由此推測ChAT可能為尼古丁在牙周組織的作用靶點,在吸煙相關性牙周炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R781.4
【圖文】：

圖1 PDLF 原代及第4代細胞培養(yǎng)P0：PDLF 原代培養(yǎng) P4：PDLF 第4代培養(yǎng)1.4.2 細胞鑒定第4代培養(yǎng)細胞經(jīng)免疫組化染色鑒定，波形絲蛋白陽性，角蛋白陰性，證明所培養(yǎng)細胞為來自中胚層（圖2）。IHCIHCV 10× C10×

1.4.2 細胞鑒定第4代培養(yǎng)細胞經(jīng)免疫組化染色鑒定，波形絲蛋白陽性，角蛋白陰性，證明所培養(yǎng)細胞為來自中胚層（圖2）。圖2 波形絲蛋白及角蛋白免疫組化染色V：波形絲蛋白 C：角蛋白IHCIHCV 10× C10×

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