【摘要】：目的:顳下頌關節(jié)炎(temporomandibularjointosteoaritis,TMJ-OA)是口腔頜面部常見的疾病之一,常伴顳下頜關節(jié)區(qū)疼痛;張口受限;伴有骨贅增生時,可有摩擦音等癥狀,嚴重影響患者的日常生活。目前的研究現(xiàn)狀多集中在軟骨細胞的自噬、信號通路的失調(diào)、節(jié)律基因等方面。但其具體的發(fā)病機制尚未完全明了。非編碼小RNA(miRNA)是一種長度約22-24個核苷酸的小RNA,其通過與靶基因mRNA結(jié)合抑制蛋白翻譯過程。非編碼小RNA自發(fā)現(xiàn)已25余年,因其眾多的靶基因為原癌基因及抑癌基因,其在腫瘤領域而備受關注。但其在關節(jié)炎的研究則鮮有報道。本課題目的是探討miR-21與顳下頜關節(jié)炎(temporomandibular joint osteoaritis,TMJ-OA)的關系,明確miR-21通過靶向TIMP-3來調(diào)控IL-6介導的小鼠髁突軟骨細胞外基質(zhì)的降解及VEGF-A的表達。方法:(1)采用3-4周齡C57小鼠提取髁突軟骨細胞,在無菌環(huán)境下,采用“脫帽法”分離小鼠髁突,將小鼠髁突軟骨沖洗,剪碎,仔細剪切至1r丨mm3的碎塊。軟骨塊中加入0.25%的胰酶置于37℃恒溫箱孵育10分鐘,然后,在濃度為0.25%的Ⅰ型膠原酶和0.25%的dispase酶Ⅱ中消化2小時。將提取的原代的小鼠髁突軟骨細胞體外培養(yǎng),鏡檢觀察其生長變化情況和細胞形態(tài),并用細胞形態(tài)學方法鑒定分離、培養(yǎng)的細胞為髁突軟骨細胞。將提取的小鼠髁突軟骨細胞隨機分為四組,即miR-21 inhibitor NC組,miR-21 inhibitor組,miR-21 inhibitor NC+IL-6組,miR-21 inhibitor+IL-6組。使用CCK-8法檢測各組細胞增殖活性,9孔培養(yǎng)板每孔接種細胞5×103個,每孔加10ul細胞計數(shù)試劑kit-8,分別于6h、48h細胞計數(shù),酶標儀在450nm處記錄吸光值;(2)qRT-PCR和Western b1ot檢測miRNA-21模擬物其抑制劑對TIMP-3、MMP-9、VEGF-1、col-1、AggmRNA及蛋白表達的影響(3)取第2代處于對數(shù)生長期髁突軟骨細胞隨機分為四組,分別用O、1、5、1Ong/mlIL-6處理24小時,對各組之間TIMP-3、Agg、col-蛋白和mRNA表達量進行檢測,并篩選出能造成髁突軟骨細胞炎性狀態(tài)的IL-6最佳濃度。Western blot檢測miR-21 inhibitor NC組,miR-21 inhibitor組,miR-21 inhibitor NC+IL-6組,miR-21 inhibitor+IL-6組,中TIMP-3、MMP-9、VEGF-、col-1、agg蛋白的表達;microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預測miRNA-21靶基因TIMP-3,雙熒光素酶標記實驗用于驗證miR-21的靶基因;(4)驗證TIMP-3是否參與miR-21對細胞外基質(zhì)的作用,該實驗分為兩部分,第一部分分組:miR-21-NC+TIMP-3-NC組、miR-21-NC+siTIMP-3組、miR-21-inhibitor+siTIMP-3-NC組、miR-21-inhibitor+siTIMP-3組;第二部分各組應用10ng/ml IL-6以驗證其在急性炎癥中的作用,白介素6刺激24h后,rt-PCR和western用于測定TIMP-3,2型膠原,agg,VEGF-A和MMP-9的mRNA和蛋白的在各組的表達。結(jié)果:(1)鏡檢見分離的原代小鼠髁突軟骨細胞呈卵圓形,形態(tài)規(guī)則,體外培養(yǎng)5—7天后,可見呈“鋪路石”樣外觀,形態(tài)飽滿。(2)miR-21 inhibitor對比miR-21-NC組,在mRNA和蛋白水平上,MMP9,VEGF-A表達顯著下調(diào),而coll,Agg,TIMP-3表達顯著上調(diào)。miR-21 mimic對比miR-21-NC組顯著上調(diào)MMP-9、VEGF-A表達,下調(diào)col-l、Agg的表達;(3)Agg,col-1,TIMP-3表達量隨IL-6濃度上調(diào)而下降;測定WT組,miR-21敲除組,WT+IL-6組和miR-21敲除+IL-6組中特定基因的表達,結(jié)果提示在10ng/ml IL-6刺激下,較wt組,miR-21敲除組中Agg,TIMP-3表達顯著上調(diào),MMP-9表達顯著下調(diào)。下調(diào)miR-21表達可延緩IL-6介導的急性炎癥,減少細胞外基質(zhì)的降解。在IL-6刺激下,相較于miR-21 inhibitor組,miR-21 inhibitor-NC組VEGF-A表達量顯著下調(diào);同時CCK-8增殖試驗證實miR-21 inhibitor組的軟骨細胞增值速度優(yōu)于miR-21 inhibitor-NC組。miR-21 inhibitor-NC+IL-6組細胞的生長速度慢于miR-21 inhibitor +IL-6組。(4)軟骨細胞轉(zhuǎn)染TIMP-3 siRNA后,TIMP-3蛋白和mRNA表達量顯著下調(diào),并可下調(diào)col-1,Agg的表達和上調(diào)VEGF-A和MMP-9的表達。對比共轉(zhuǎn)染miR-21-inhibitor和siTIMP-3-NC組,共轉(zhuǎn)染miR-21-inhibitor和si-TIMP3組可顯著下調(diào)Agg,coll的蛋白和mRNA表達,同時上調(diào)VEGF-A和MMP-9的表達。4組細胞均應用10ng/ml IL-6刺激24h,可產(chǎn)生與未應用IL-6刺激組相似的效果.
【圖文】：

在ＣＣＫ－８實驗中，小鼠髁突軟骨細胞轉(zhuǎn)染ｍｉＲ－２〗ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ后，相較于對照組，逡逑細胞增殖加快，兩組之間有統(tǒng)計學差異（Ｐ＜０．０５）。給與１０ｎｇ／ｍｌ邋ＩＬ－６刺激后，逡逑ＣＣＫ－８試驗顯示出相似的結(jié)果（圖４）。逡逑１．４．實驗三ＭｉＲ－２１對ＩＬ－６介導的炎性髁突軟骨的細胞外基質(zhì)的影響逡逑１．４．１實驗方法逡逑（１）取Ｐ２邋ＭＣＣｓ，隨機分為４組，分組如表２逡逑表２．邋ＭｉＲ－２１對炎性髁突軟骨的關鍵蛋白及細胞外基質(zhì)的影響實驗分組逡逑分組邐ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ＮＣ邐ＮＣ＋邋ＩＬ－６邐＋邋ＩＬ－６逡逑（２）其余步驟同１．２．１逡逑１．４．２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋檢測邋Ｔｉｍｐ－３邋及邋Ａｇｇ、Ｃｏｌ－１、ＭＭＰ－９邋和邋ＶＥＧＦ－Ａ邋的蛋白表達水逡逑平逡逑同邋１．２．３逡逑１．４．２結(jié)果逡逑２５逡逑

邐ｒｖｉｏｒ逡逑圖６逡逑ＭｉＲＢａｓｅ提示：ｍｉＲ－２１與ＴＩＭＰ－３有互補序列（圖６Ａ）。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析顯示轉(zhuǎn)入ＭｉＲ－２１邋ｍｉｍｉｃ會有效抑制Ｔｉｍｐ－３的表達，而其逡逑ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ會增高Ｔｉｍｐ－３的表達（圖６Ｂ）。逡逑熒光素酶實驗結(jié)果顯示（圖６Ｃ），ＭｉＲ－２１會有效抑制ＷＴ中ＴＩＭＰ－３的熒光素逡逑酶效應，而在突變型中，，我們阻斷了邋ＭｉＲ－２１的活性位點，從而阻止了次抑制效逡逑應。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析也顯示轉(zhuǎn)入ＭｉＲ－２１邋ｍｉｍｉｃ會有效抑制Ｔｉｍｐ－３的表達，而逡逑其ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ會增高Ｔｉｍｐ－３的表達。逡逑２邋實驗二ＭｉＲ－２１靶向ＴＩＭＰ－３調(diào)控ＩＬ－６介導的細胞外基質(zhì)的降解逡逑２．１實驗試劑與儀器逡逑２．邋１．１主要試劑逡逑Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋Ｍｕｒｉｎｅ邋ＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，美國）；逡逑Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ邋２０００邋ｒｅａｇｅｎｔ邋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，邋ＵＳＡ）逡逑Ｉ型膠原兔抗小鼠多克隆抗體（Ｓｉｇｍａ，美國）；逡逑２９逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R782.6

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本文編號：2711633