發(fā)布時間：2020-06-08 13:40

【摘要】：目的:Nell-1(Nel-like molecule-1)在成骨分化和骨再生中起到重要作用。前期研究表明Nell-1可以正向調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細胞分化和牙本質(zhì)的形成。我們研究小組發(fā)現(xiàn),Nell-1可以與神經(jīng)標記物共表達。本實驗的目的是通過體內(nèi)和體外研究探討Nell-1蛋白在牙髓細胞神經(jīng)向分化過程中是否發(fā)揮正向調(diào)控作用。材料和方法:1.采用免疫熒光雙染技術(shù)對大鼠牙髓組織切片進行Nell-1與神經(jīng)標記物P物質(zhì)(Substance P,SP),巢蛋白(Nestin)的染色,來觀察Nell-1在大鼠牙髓組織中的分布及其與牙髓神經(jīng)的關(guān)系。2.建立大鼠牙髓炎模型,將浸有Nell-1蛋白的膠原海綿植入大鼠牙髓腔內(nèi),免疫組化染色來觀察Nell-1蛋白在炎癥環(huán)境中對牙髓細胞神經(jīng)標記物的作用。3.利用組織塊酶消化法培養(yǎng)人牙髓細胞。采用單克隆法獲得牙髓干細胞。采用流式細胞術(shù)來檢測干細胞表面標記物。成骨誘導液誘導,茜素紅染色來觀察牙髓干細胞成骨分化能力。成脂誘導液誘導,油紅O染色觀察牙髓干細胞成脂分化能力。神經(jīng)誘導液誘導人牙髓干細胞,采用免疫細胞化學染色觀察細胞形態(tài)改變及相關(guān)神經(jīng)標記物變化。4.將人牙髓干細胞分別與0、50、75、100、125ng/mL的Nell-1蛋白共培養(yǎng)12h、24h、72h。利用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測神經(jīng)相關(guān)基因(Nestin、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-LⅡ微管蛋白(β-LⅡtubulin))在mRNA水平上的表達,Western Blot技術(shù)檢測(Nestin、GFAP)基因在蛋白水平上的表達。初步探索Nell-1蛋白對人牙髓干細胞神經(jīng)向分化的調(diào)控作用并確定Nell-1蛋白的最佳有效濃度。結(jié)果:1.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),Nell-1在正常牙髓組織中有大量表達,并且與神經(jīng)標記物SP,Nestin共表達。2.在大鼠牙髓炎模型中,Nell-1組大鼠牙髓細胞神經(jīng)標記物SP,NSE,Nestin表達呈強陽性。3.利用組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出了人牙髓原代細胞。單克隆法獲得牙髓干細胞。流式細胞儀檢測牙髓干細胞表面標記物,CD90、CD44陽性,CD34、CD45陰性。茜素紅染色后在顯微鏡下觀察成骨誘導14天,有明顯礦化結(jié)節(jié)形成,油紅O染色后在顯微鏡下觀察成脂誘導21天細胞內(nèi)有桔紅色脂滴。細胞免疫組織化學染色在顯微鏡下觀察成神經(jīng)誘導后4天細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,呈現(xiàn)長突觸多邊形形態(tài)并且相關(guān)神經(jīng)標記物GFAP、NSE表達強陽性。4.人牙髓干細胞與Nell-1蛋白共培養(yǎng)12h,24h,72h后,Nell-1蛋白濃度在100 ng/mL時神經(jīng)相關(guān)基因Nestin,β-Ⅲ tubulin,GFAP mRNA表達量最高。相關(guān)基因GFAP,Nestin蛋白表達量較高。結(jié)論:1.Nell-1在大鼠牙髓神經(jīng)中表達,Nell-1蛋白刺激能夠促進大鼠牙髓干細胞表面神經(jīng)標記物表達量升高。2.組織塊酶消化法培養(yǎng)人牙髓細胞高效且狀態(tài)佳。成骨,成脂,成神經(jīng)向分化實驗證明單克隆培養(yǎng)的牙髓干細胞具有多向分化潛能。流式細胞術(shù)證明牙髓干細胞為間充質(zhì)干細胞。3.Nell-1蛋白在體外與人牙髓干細胞共培養(yǎng),能夠刺激人牙髓干細胞表面神經(jīng)因子表達量增加。
【圖文】：

１．３實驗結(jié)果逡逑１．３．１邋Ｎｅｌｌ－１在大鼠牙毮神經(jīng)中的表達以及與神經(jīng)標記物的關(guān)系逡逑采用ＨＥ染色觀察大鼠磨牙組織學結(jié)構(gòu)（圖１．邋Ａ，Ｆ）。通過免疫熒光染色觀察牙逡逑髓組織內(nèi)Ｎｅｌｌ－１的分布及其與神經(jīng)標記物的關(guān)系。Ｎｅｌｌ－１在牙髓組織中呈陽性表逡逑達（圖１．邋Ｃ，Ｈ），神經(jīng)標記物ＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎ在大鼠牙髓神經(jīng)中有表達（圖１．邋Ｄ，Ｉ）。在逡逑大鼠牙髓組織中Ｎｅｌｌ－１與ＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎ共表達（圖１．邋Ｅ，Ｊ）。細胞核采用ＤＡＩ＞Ｉ染色逡逑（圖１．邋Ｂ，Ｇ）。該實驗結(jié)果表明Ｎｅｌｌ－１在牙髓神經(jīng)中有表達，可能在牙髓細胞的神逡逑經(jīng)向分化中發(fā)揮一定的作用。逡逑１~枴觥觥觥觥觥觥觥鰣義襄危澹擼擼擼擼咤義希模粒校懾危危牛蹋蹋卞危櫻繡危停澹潁紓邋義賢跡貝笫竽パ潰危澹歟歟庇肷窬喙乇曇俏錈庖哂餿舊義獻ⅲ捍笫竽パ雷櫓釁齲湃舊兔庖哂餿舊�。｝x湃舊汕邐允狙浪瑁辣懼義現(xiàn)矢春轄峁梗ㄍ跡玻�，，Ｆ１００ＸｈＮｅe歟煸詿笫笱浪枳櫓械謀澩錚ㄍ跡玻�，｝x保埃埃兀�。辶x希櫻�、Ｎｅｓｔｉｎ等神经标志午澰燇鼠牙髓讬┋中睗湾Pㄍ跡玻澹�，劐１００Ｘ）。细胞簲\緬義希模粒校扇舊ㄍ跡玻咤澹攏清澹保埃埃兀�。Ｎｅe歟庇肷窬曇俏錒脖澩錚ㄍ跡玻澹�，Ｊ邋１００Ｘ）。ｄ，辶x涎辣局�；７w浪�。辶x希保沖義

本文編號：2703167