季銨鹽型抗菌單體改性牙本質(zhì)粘接劑的抗菌性能研究

發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 05:42

【摘要】： 復(fù)合樹脂及粘接系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于修復(fù)牙體組織缺損,改善牙齒顏色和外觀。但因缺乏有效的抗菌性能,復(fù)合樹脂材料表面容易聚積菌斑;樹脂材料的聚合收縮和粘接不良可形成界面微滲漏,成為致齲菌的侵入通道。因此,繼發(fā)齲常影響樹脂修復(fù)體遠(yuǎn)期臨床效果,是修復(fù)失敗的重要原因。目前,開發(fā)具有抗菌功能的復(fù)合樹脂和粘接系統(tǒng)受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,希望借此減少繼發(fā)齲的發(fā)生。有研究將抗菌劑添加至樹脂基質(zhì),依賴抗菌劑的釋放獲得抗菌功能。但抗菌成分的添加和釋放會影響材料的力學(xué)性能和美學(xué)效果,且獲得的抗菌性能難以穩(wěn)定持久。為克服上述抗菌改性方式的不足,研究者嘗試開發(fā)可聚合抗菌單體用于樹脂材料抗菌改性,將抗菌功能基團(tuán)接枝共聚于樹脂基質(zhì),發(fā)揮穩(wěn)定的接觸性抗菌作用,且無損材料的機(jī)械性能,具有良好的應(yīng)用前景。據(jù)此,本課題組合成了多種可聚合季銨鹽抗菌功能單體,其中甲基丙烯酰氧乙基一正十六烷基一二甲基氯化銨(methacryloxylethyl cetyl dimethyl ammonium chloride,DMAE-CB),對口腔常見細(xì)菌具有較強(qiáng)的殺菌作用,因此作為備選單體用于樹脂材料抗菌改性。評價(jià)修復(fù)材料抗菌效果的研究多局限于應(yīng)用瓊脂平板彌散法對抑菌環(huán)的觀察,材料浸提液對細(xì)菌懸液的作用,以及材料對浮游狀態(tài)細(xì)菌生長的影響等。上述實(shí)驗(yàn)均可用于檢測材料的溶出性抗菌性能,但無法準(zhǔn)確評價(jià)含有季銨鹽抗菌單體的高分子牙科材料的接觸性抗菌性能。此外,實(shí)驗(yàn)中采用浮游狀態(tài)細(xì)菌進(jìn)行抗菌研究,同口腔環(huán)境中的菌斑生物膜相差甚遠(yuǎn)。細(xì)菌在形成菌斑生物膜后,基因表達(dá)和生物學(xué)行為發(fā)生改變,耐藥性顯著提高。因此,體外培養(yǎng)生物膜,研究抗菌材料表面對生物膜形成和生態(tài)特征的影響,對于準(zhǔn)確評估材料的臨床應(yīng)用前景尤為重要。 1主要研究目的: 將季銨鹽抗菌單體DMAE-CB添加到商品化牙本質(zhì)粘接劑Single Bond 2中,獲得改性粘接劑作為實(shí)驗(yàn)組,并以Single Bond 2作為陰性對照,含有抗菌單體MDPB的粘接系統(tǒng)Clearfil Protect Bond作為陽性對照。評價(jià)DMAE-CB改性牙本質(zhì)粘接劑固化后的抗菌效果,及其對菌斑生物膜形成和活性的影響,初步探索固定于高分子網(wǎng)絡(luò)的季銨鹽基團(tuán)抑制細(xì)菌生長和生物膜形成的機(jī)理。 2主要研究方法: 2.1采用接觸抑菌實(shí)驗(yàn)評價(jià)改性粘接劑的固化表面對變形鏈球菌生長的影響。 2.2研究老化處理和唾液處理對改性粘接劑固化表面抗菌性能的影響。 2.3分析變形鏈球菌在粘接劑浸提液中的生長動(dòng)力學(xué)和倍增時(shí)間,檢測材料浸提液的抗菌活性。 2.4利用熒光指示劑和激光共聚焦掃描顯微鏡評價(jià)改性粘接劑固化表面對變形鏈球菌胞膜完整性的影響,初步探索固定于高分子網(wǎng)絡(luò)的季銨鹽基團(tuán)的抗菌機(jī)理。 2.5改性粘接劑固化表面進(jìn)行變鏈生物膜和全菌生物膜的體外培養(yǎng),通過光密度值評價(jià)改性材料對變鏈生物膜和全菌生物膜形成的影響。 2.6采用光密度值分析,評價(jià)改性粘接劑的固化表面經(jīng)老化處理后對體外變鏈生物膜和全菌生物膜形成的影響。 2.7掃描電鏡觀察改性粘接劑表面變鏈生物膜和全菌生物膜初步形成和成熟過程,驗(yàn)證改性材料對生物膜形成的影響。 2.8應(yīng)用熒光指示劑和激光共聚焦掃描顯微鏡研究改性材料表面變鏈生物膜和全菌生物膜的三維活性結(jié)構(gòu)。 2.9改性材料表面培養(yǎng)變鏈生物膜,收集生物膜變鏈和孵育液中浮游變鏈,進(jìn)行RNA抽提和實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析,檢測改性材料表面生物膜變鏈和孵育液中浮游變鏈的gtf基因表達(dá)水平,初步探索固定于高分子網(wǎng)絡(luò)的季銨鹽基團(tuán)抑制生物膜形成的機(jī)理。 3主要研究結(jié)果: 3.1固化后的DMAE-CB改性粘接劑可抑制表面變形鏈球菌的生長,生長抑制率約為99%(P 0.05)。 3.2老化處理或唾液處理后,改性材料表面仍表現(xiàn)出抗菌活性:細(xì)菌生長抑制率分別約為99% (P 0.05)和90% (P 0.05)。 3.3改性粘接劑的浸提液無抗菌活性:實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組浸提液中變形鏈球菌指數(shù)生長期擬合直線的斜率及細(xì)菌的倍增時(shí)間均無顯著差異(P 0.05)。 3.4熒光染色標(biāo)記后,細(xì)胞膜完整的細(xì)菌染為綠色,胞膜受損的細(xì)菌染為紅色。陰性對照粘接劑固化表面細(xì)菌密集;改性粘接劑和陽性對照粘接劑表面細(xì)菌附著較少。 3.5熒光強(qiáng)度分析顯示各組的總熒光強(qiáng)度FIt和紅綠熒光強(qiáng)度比值FIr/FIg的差異顯著(P 0.05);陰性對照組的FIt值最高而FIr/FIg最低(P 0.05),提示改性粘接劑組和陽性對照可以損傷變形鏈球菌胞膜的完整性,減少細(xì)菌粘附。 3.6同陰性對照相比,改性粘接劑和陽性對照組的固化表面可抑制表面變鏈生物膜和全菌生物膜的形成(P 0.05)。 3.7老化處理后改性材料和陽性對照的表面,變鏈生物膜和全菌生物膜形成量較老化前均無顯著提高(P 0.05),仍表現(xiàn)出抑制表面生物膜形成的作用(P 0.05)。 3.8掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn):改性粘接劑表面變鏈生物膜孵育4 h,可見變鏈和細(xì)胞外基質(zhì)散在分布;孵育24 h,形成松散的變鏈生物膜。改性粘接劑表面的全菌生物膜孵育4 h,可見細(xì)菌殘骸;孵育24 h后,形成全菌生物膜。 3.9改性粘接劑表面的變鏈生物膜和全菌生物膜的厚度和總體活性均較陰性對照組下降。 3.10粘接劑表面生物膜變鏈的gtfBCD基因表達(dá),三組之間有所差異:陽性對照組和改性粘接劑組的生物膜變鏈gtfB表達(dá)分別下降為陰性對照的23%和8.6% (P 0.05),gtfC的表達(dá)分別下降為陰性對照的35.9 %和14.1 % (P 0.05);而陽性對照組和改性粘接劑組gtfD的表達(dá)同陰性對照之間沒有顯著差異(P 0.05)。 3.11試件孵育液中的浮游態(tài)細(xì)菌的gtfB、gtfC和gtfD的RNA拷貝數(shù),三組之間均無顯著差異(P 0.05)。 4主要結(jié)論: 4.1 DMAE-CB改性粘接劑固化后可以抑制表面細(xì)菌生長和粘附。 4.2老化處理后DMAE-CB改性材料仍表現(xiàn)出抗菌活性,提示季銨鹽單體改性牙本質(zhì)粘接劑可以長期發(fā)揮抗菌作用。 4.3唾液預(yù)處理后DMAE-CB改性材料仍表現(xiàn)出抗菌活性,提示季銨鹽單體改性粘接劑可在口腔環(huán)境中發(fā)揮抗菌作用,具有臨床應(yīng)用前景。 4.4排除了抗菌單體從改性粘接劑固化樣本中溶出發(fā)揮抗菌作用的可能,明確了DMAE-CB改性粘接劑固化后具有接觸性抗菌性能。 4.5 DMAE-CB改性粘接劑可以影響所接觸細(xì)菌的胞膜完整性,由此部分解釋固定于樹脂基質(zhì)中陽離子抗菌基團(tuán)的抗菌機(jī)制。 4.6 DMAE-CB改性粘接劑和含有抗菌單體MDPB的陽性對照粘接劑的固化表面可以抑制變形鏈球菌生物膜和全菌生物膜的形成。 4.7老化處理后,DMAE-CB改性粘接劑和陽性對照的固化表面對變形鏈球菌生物膜和全菌生物膜形成的抑制作用無明顯衰減。 4.8 DMAE-CB改性粘接劑表面可下調(diào)變鏈生物膜和全菌生物膜的活性。 4.9 DMAE-CB改性粘接劑和陽性對照的固化表面可以選擇性下調(diào)生物膜變鏈的gtf基因表達(dá),由此部分解釋固定于樹脂基質(zhì)中陽離子抗菌基團(tuán)抑制變鏈生物膜形成的機(jī)制。 4.10抗菌單體改性材料表面對gtf基因表達(dá)的影響局限于材料表面的變鏈生物膜,排除了抗菌單體從粘接樣本中溶出發(fā)揮抗菌作用的可能,明確了DMAE-CB改性粘接劑具有接觸性抗菌性能。綜上,可聚合季銨鹽抗菌單體DMAE-CB可以用于牙本質(zhì)粘接劑抗菌改性,改性材料固化后,陽離子抗菌基團(tuán)固定于樹脂基質(zhì)網(wǎng)絡(luò),影響變形鏈球菌生長、粘附、胞膜完整性,以及影響生物膜的形成和活性,選擇性下調(diào)變形鏈球菌gtf基因表達(dá)水平,發(fā)揮抗菌、抑制生物膜形成的作用,賦予粘接劑持久穩(wěn)定的接觸性抗菌活性。
【圖文】：

示意圖,材料結(jié)構(gòu),抗菌性能,示意圖