【摘要】：目的： 通過(guò)組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞(1uman gingival fibroblast, HGFs),觀察HGFs體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性,探討人類β-防御素3(Human Beta-Defensins3, hBD3)對(duì)HGFs增殖情況的影響,通過(guò)分析hBD3及與Pg-LPS聯(lián)合作用對(duì)HGFs分泌PGE2和MMP-1的情況,初步探討此過(guò)程中可能涉及到的TLR, MAPK, PI3K, NF-κB各級(jí)信號(hào)通路。研究hBD3在牙周炎致病機(jī)制方面的作用。 方法： 1.組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免疫組織化學(xué)方法鑒定細(xì)胞來(lái)源,3-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl terazolium, MTT)動(dòng)態(tài)檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞在不同濃度hBD3干預(yù)下增殖情況。 3.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)檢測(cè)不同濃度hBD3不同時(shí)間點(diǎn)HGFs上清液中PGE2和MMP-1的含量,以及加入Pg-LPS以及不同信號(hào)抑制劑產(chǎn)生PGE2和MMP-1的量。 4.特定濃度hBD3,分別與等體積NF-κB信號(hào)抑制劑SN-50,50UM; PI3K信號(hào)抑制劑LY294002,20UM; JNK信號(hào)抑制劑SP600125,20UM; P38信號(hào)抑制劑SB203580,20UM; ERK信號(hào)抑制劑PD98059,10UM,分析hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1涉及的信號(hào)通路。 結(jié)果： 1.采用組織塊培養(yǎng)法能夠在體外成功培養(yǎng)出HGFs。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞胞核均染,呈長(zhǎng)梭形,并圍繞組織塊呈放射狀排列。抗角蛋白染色陰性,抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性,可見(jiàn)細(xì)胞來(lái)源于中胚層,結(jié)合取材部位證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為HGFs。 2.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,10ug/ml的hBD3分別與對(duì)照組和0.3ug/ml組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；10ug/ml的hBD3對(duì)HGFs的增殖作用最顯著。第3天細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第5-6天細(xì)胞生長(zhǎng)減緩,第7天逐漸進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線大致呈S形。 3. ELISA法檢測(cè)顯示,1ug/ml hBD3與對(duì)照組及10ug/ml hBD3組相比刺激HGFs產(chǎn)生PGE2差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著時(shí)間延長(zhǎng),PGE2的分泌量高于其他組；而對(duì)于MMP-1, hBD3濃度為1ug/ml時(shí),與對(duì)照組及0.3ug/ml hBD3濃度組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著時(shí)間延長(zhǎng),MMP-1的分泌量高于其他組。 4.hBD3組與Pg-LPS組,Pg-LPS+hBD3組比較,在刺激HGFs產(chǎn)生PGE2和MMP-1的過(guò)程中Pg-LPS作用最強(qiáng),hBD3組最弱,且三組之間均有顯著性差異。 5.hBD3聯(lián)合多種信號(hào)通路(TLR, MAPK, PI3K, NF-κB)抑制劑,刺激HGFs產(chǎn)生PGE2和MMP-1的量均下降,且減少的量與信號(hào)抑制劑種類相關(guān)。hBD3刺激HGFs產(chǎn)生PGE2的過(guò)程可被SP600125,SC-3060特異性阻斷；產(chǎn)生MMP-1過(guò)程中可被SB203580, PD98059, SC-3060, anti-TLR2抗體特性性阻斷。 結(jié)論： 1.組織塊培養(yǎng)法可成功培育出HGFs;細(xì)胞生長(zhǎng)代謝旺盛,分裂較快,滿足實(shí)驗(yàn)要求,培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌操作,避免污染,是確保細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。 2.一定濃度的hBD3能促進(jìn)HGFs增殖及其分泌PGE2和MMP-1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1ug/ml為hBD3的最佳效應(yīng)濃度,最佳顯效時(shí)間為12h。 3.hBD3, Pg-LPS, hBD3+Pg-LPS三者作用HGFs產(chǎn)生PGE2, MMP-1的結(jié)果說(shuō)明：Pg-LPS刺激產(chǎn)生PGE2, MMP-1作用最強(qiáng),可見(jiàn)Pg-LPS對(duì)牙周組織具有較高的毒性,在牙周病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；hBD3在致炎方面與Pg-LPS相比作用較弱；hBD3與Pg-LPS聯(lián)合作用時(shí),hBD3抵消部分Pg-LPS產(chǎn)生PGE2, MMP-1的作用,使得Pg-LPS致炎作用減弱。 4.hBD3刺激HGFs產(chǎn)生PGE2是通過(guò)MAPK中的JNK通路和NF-κB通路；hBD3刺激HGFs產(chǎn)生MMP-1過(guò)程中涉及了TLR2和MAPK中的P38、ERK信號(hào)通路以及NF-κB通路。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781.42

【參考文獻(xiàn)】

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1 張維瓊;吳巧英;汪國(guó)華;;防御素在口腔疾病中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年04期

2 許麗華;武海春;董福生;楊冬茹;李彬;;LPS刺激對(duì)體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞環(huán)氧合酶表達(dá)的影響[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

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本文編號(hào)：2696132